基于TaqMan-qPCR技术的OsWx基因编辑水稻检测方法的建立

doi:10.19586/j.2095-2341.2024.0154

生物技术进展 ›› 2025, Vol. 15 ›› Issue (1): 86-92.DOI: 10.19586/j.2095-2341.2024.0154

基于TaqMan-qPCR技术的OsWx基因编辑水稻检测方法的建立

胡广¹^,²(), 王智², 付伟³, 石雨婷⁴, 陈珊珊², 罗亮², 魏霜¹()

^1.广州海关技术中心，广州 510423
^2.中国检验检疫科学研究院，北京 100176
^3.农业农村部科技发展中心，北京 100176
^4.湖南农业大学生物科学技术学院，长沙 410128

收稿日期:2024-09-25 接受日期:2024-10-31 出版日期:2025-01-25 发布日期:2025-03-07
通讯作者: 魏霜
作者简介:胡广 E-mail：huguang@caiq.org.cn;
基金资助:
广东省基础与应用基础研究基金项目(2022A1515110843)

Establishment of Detection Method Based on TaqMan Real-time Fluorescence Quantitative PCR Technology for OsWx-edited Rice

Guang HU¹^,²(), Zhi WANG², Wei FU³, Yuting SHI⁴, Shanshan CHEN², Liang LUO², Shuang WEI¹()

^1.Technology Center of Guangzhou Customs District，Guangzhou 510423，China
^2.Chinese Academy of Inspection and Quarantine，Beijing 100176，China
^3.Development Center of Science and Technology，Ministry of Agriculture and Rural Affairs，Beijing 100176，China
^4.College of Bioscience and Biotechnology，Hunan Agricultural University，Changsha 410128，China

Received:2024-09-25 Accepted:2024-10-31 Online:2025-01-25 Published:2025-03-07
Contact: Shuang WEI

摘要/Abstract

摘要：

基因编辑技术已成为当前一个重要的分子工具，通过定向改造基因组序列，在基因功能分析和作物遗传育种等方面具有广泛应用。随着基因编辑技术的快速发展，当前其可对受体生物实现几乎无痕编辑，这增加了对基因编辑产品的检测难度。因此，建立基因编辑产品的检测方法，有利于加强对市场上基因编辑产品的监管。以OsWx基因CRISPR/Cas9基因编辑材料为研究对象，设计编辑位点的特异性引物和探针进行TaqMan实时荧光定量PCR（TaqMan-qPCR）检测。研究所建立的检测体系具有良好的特异性和灵敏度，能够有效地区分OsWx单碱基突变体与野生型水稻。

关键词: 基因编辑, TaqMan-qPCR, CRISPR/Cas9, OsWx

Abstract:

Gene editing technology currently has become an important molecular tool， which can selectively modify genome sequences and has wide applications in gene function analysis and crop genetic breeding. Due to the rapid development of gene editing technology， gene editing techniques can perform almost seamless editing on receptor organisms， which increases the difficulty of detecting the gene editing product. Therefore， the establishment of detection methods for gene editing products is conducive to strengthening market supervision of the gene editing product. This study was based on TaqMan real-time fluorescence quantitative PCR （TaqMan-qPCR） technology for detection to design specific primers and probes for the editing site of OsWx gene by developed with CRISPR/Cas9. In this study， the detection system had good specificity and sensitivity， and could effectively distinguish OsWx single base mutants from wild-type rice.

Key words: gene editing, TaqMan-qPCR, CRISPR/Cas9, OsWx

中图分类号:

Q812

胡广, 王智, 付伟, 石雨婷, 陈珊珊, 罗亮, 魏霜. 基于TaqMan-qPCR技术的OsWx基因编辑水稻检测方法的建立[J]. 生物技术进展, 2025, 15(1): 86-92.

Guang HU, Zhi WANG, Wei FU, Yuting SHI, Shanshan CHEN, Liang LUO, Shuang WEI. Establishment of Detection Method Based on TaqMan Real-time Fluorescence Quantitative PCR Technology for OsWx-edited Rice[J]. Current Biotechnology, 2025, 15(1): 86-92.

图/表 9

图1 靶位点在OsWx基因组DNA上的位置注：红色字体为PAM序列；黄色字体为靶位点（852~871 bp）；蓝色方块表示OsWx基因外显子；灰色方块表示非翻译区（untranslated region，UTR）；箭头表示基因组序列从5'到3'。

Fig. 1 Position of the target site on OsWx genomic DNA

表1 引物序列

Table 1 Primer sequences

引物名称		序列（5'→3'）
Primer1	F1	5'-GACTGAGCTTAGCTTCCAC-3'
Primer1	R1	5'-CACTGACCTGGCAAAGAA-3'
Primer2	F2	5'-CCACTGGTGATTTCAGGT-3'
Primer2	R2	5'-ACTCGTGATGCTTCCAAC-3'
Primer3	F3	5'-GCAGTTGGACTGAGCTT-3'
Primer3	R3	5'-CTGGCAAAGAAGGCTGAA-3'
Primer4	F4	5'-GACTGAGCTTAGCTTCCAC-3'
Primer4	R4	5'-ACTCGTGATGCTTCCAAC-3'
Primer5	F5	5'-GCTTCCACTGGTGATTTC-3'
Primer5	R5	5'-GCTTCCAACCATCATCAG-3'

表2 引物和探针序列

Table 2 Primer and probe sequences

名称	探针序列(5'→3')	5'修饰	3'修饰
P1	5'-ACCGGTGAGAAGATCTACGGACCT-3'	FAM	TAMRA
P2	5'-CCGGTGAGAAGATCTACGGACCT-3'	FAM	TAMRA
P3	5'-AGACCGGTGAGAAGATCTACGGACC-3'	FAM	TAMRA
P4	5'-ACCGGTGAGAAGATCTACGGACC-3'	FAM	TAMRA
P5	5'-AGGTCCGTAGATCTTCTCACCGGT-3'	FAM	TAMRA
OsPLD-F	5'-TGGTGAGCGTTTTGCAGTCT-3'	-	-
OsPLD-R	5'-CTGATCCACTAGCAGGAGGTCC-3'	-	-
OsPLD-P	5'-TGTTGTGCTGCCAATGTGGCCTG-3'	FAM	BHQ1

表3 基因编辑水稻

Table 3 Genome editing of rice

品系	靶基因序列（5'→3'）	突变类型
WT	5'-GACCGGTGAGAAGATCTACGGACCTGA-3'	-
oswx-9	5'-GACCGGT---------------------------GACCTGA-3'	删除
oswx-13	5'-GACCGGTGTAGAAGATCTACGGACCTGA-3'	插入
oswx-22	5'-GACCGGTGA--AAGATCTACGGACCTGA-3'	删除

图2 引物扩增产物电泳图注：M—DNA maker; 泳道1~5—primer 1~5。

Fig. 2 Electropherogram of primer amplification product

图3 扩增曲线A：内参基因OsPLD扩增曲线； B~F: P1~P5扩增曲线；WT—日本晴；MUT—OsWx突变体。

Fig. 3 Diagram of amplification curve

图4 qPCR体系优化扩增曲线A:上下游引物和TaqMan探针为1、1、0.5 μL；B:上下游引物和TaqMan探针为0.5、0.5、0.25 μL；C:上下游引物和TaqMan探针为0.25、0.25、0.125 μL。WT—日本晴，MUT—OsWx突变体水稻。

Fig. 4 Optimized amplification curve of qPCR system

图5 不同水稻品系扩增曲线A:内源基因OsPLD扩增曲线；B:不同水稻品系的扩增曲线。WT—日本晴，TT51—转基因水稻TT51，P7—基因编辑低镉水稻P7，MUT—OsWx突变体水稻。

Fig. 5 Amplification curves of different rice lines

图6 OsWx突变体扩增曲线A：OsPLD扩增曲线； B：基因编辑水稻品系和野生型水稻检测区分扩增曲线。WT—日本晴，MUT—基因编辑水稻oswx-13和oswx-22。

Fig. 6 Amplification curve of OsWx mutant rice

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基于TaqMan-qPCR技术的OsWx基因编辑水稻检测方法的建立

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