本期目录

生物技术进展

2019年第9卷第4期发布日期：2019-07-25

进展评述

细菌感应金属信号及调节金属稳态的研究进展
刘一超,战嵛华,柯秀彬,燕永亮
2019 Vol. 9 (4): 317-325. DOI:10.19586/j.2095-2341.2019.0024
摘要 ( ) PDF (3251KB)( )
铁、锰、锌等微量金属元素是几乎所有细菌生存所必需的，在各种关键代谢过程中起着重要的辅助因子作用。例如，铁缺乏的条件下细菌很难维持正常的生理活动，但是过量的铁也会通过Fenton反应催化活性氧物质（如羟基自由基）的形成从而对细菌造成损伤。针对环境中不断变化的金属离子可用性，结合内环境的变化，细菌进化出了以各金属离子吸收调节家族蛋白为核心的多种调控机制。这些调控元件大多是将基因调控与金属浓度相偶联的全局性转录因子家族，也是细菌金属代谢中最重要的调节因子。以细菌的铁稳态为例介绍了调控金属离子稳态的经典模式，同时对不同内外环境条件下的铁平衡和铁运输进行了详细介绍；以几种典型金属元素的胞内稳态为例介绍了目前三种已知金属感应调节器的类型，为细菌的某些未知金属稳态及其他微生物的金属传感器及金属稳态的研究提供了参考。

腺相关病毒的生产方式及其在基因治疗中的应用
杜梦潭,刘兴健,胡小元,张志芳,李轶女
2019 Vol. 9 (4): 326-331. DOI:10.19586/j.2095-2341.2019.0032
摘要 ( ) PDF (1416KB)( )
随着基因治疗产品不断得到批准用于临床研究，基因治疗相关的病毒载体也受到广泛关注，其中腺相关病毒载体因其低致病性、低免疫原性、宿主范围广泛且稳定表达等独特优势成为最有前景的病毒载体，广泛应用于临床研究，目前已有2种重组腺相关病毒载体的药品得到批准且效果显著，但由于大规模生产技术的缺乏限制了重组腺相关病毒载体的研究和广泛应用。就腺相关病毒的结构和功能、载体的生产方式及其现阶段在基因治疗中的应用进行了综述，以期为今后以腺相关病毒为载体的基因治疗大规模应用于市场提供参考。

低氧诱导因子及其抑制剂研究进展
闫东科,吕平
2019 Vol. 9 (4): 332-340. DOI:10.19586/j.2095-2341.2019.0027
摘要 ( ) PDF (3666KB)( )
低氧（hypoxia）是生物体内常见的生理和病理现象，也是常见的实体肿瘤微环境。人和其他哺乳动物体内存在一系列应对缺氧胁迫的调节机制，而低氧诱导因子（hypoxia-inducible factors，HIFs）是这些调节机制中的关键调控因子，是一类参与细胞缺氧应答反应的转录因子家族。大量研究表明，HIFs与生物体的生长、发育、血管生成、红细胞生成、细胞代谢和自噬以及肿瘤的发生、发展、转移侵袭、放化疗抗性和癌症患者的不良预后等密切相关。因此，进一步加强HIFs及其抑制剂的相关研究对于肿瘤的认识与治疗具有重要意义。从HIFs的蛋白质结构、稳定性调控、转录激活调控及其靶向抑制剂的研究进展等方面进行综述，以期为靶向HIFs的肿瘤治疗提供新线索，为新型HIFs抑制剂的研究与开发提供参考。

免疫检查点抑制剂在肿瘤治疗中的研究进展
薛雯,贾宇,江一帆,李辰新,王志明
2019 Vol. 9 (4): 341-349. DOI:10.19586/j.2095-2341.2019.0019
摘要 ( ) PDF (2223KB)( )
免疫疗法为肿瘤治疗提供了新的途径，具有独特的优势和巨大的潜力，而免疫检查点阻断是免疫治疗中的重要组成部分。目前免疫检查点阻断在临床上已取得了重要进展，国内外许多企业已研发出靶向免疫检查点的抗体，并在特定适应症中取得了良好的临床效果。详细阐述了免疫检查点中细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4（cytotoxic T lymphocyte associated antigen 4，CTLA-4）、程序性死亡受体（programmed death 1，PD-1）及其配体（programmed death ligand 1，PD-L1）的作用机制和国内外企业对其抗体药物的研发现状，并对其他免疫检查点的研究进展也做了一定的介绍，以期为免疫治疗的相关研究提供新思路。

研究论文

玉米PHYB1基因的克隆、改造及其在拟南芥中的功能分析
马晓净,赵斌斌,刘扬,马梦迪,王海洋
2019 Vol. 9 (4): 350-356. DOI:10.19586/j.2095-2341.2019.0039
摘要 ( ) PDF (4493KB)( )
光是一个重要的环境因子，影响植物生长发育的诸多方面。植物通过多种光受体感受环境中的光信号，其中以红光与远红光受体——光敏色素的研究最为透彻。研究表明，将拟南芥phyB的104位点与361位点的酪氨酸（Y）残基改造为苯丙氨酸（F）残基可增强其活性。为了研究玉米光敏色素B1（PHYB1）的功能，构建了玉米光敏色素B1基因的3种重组质粒:pZmPHYB1∷ZmPHYB1WT、pZmPHYB1∷ZmPHYB1Y98F（对应拟南芥Y104F突变）和pZmPHYB1∷ZmPHYB1Y359F（对应拟南芥Y361F突变），并将其转入拟南芥phyB-9突变体中，然后对转基因株系进行表型分析。结果表明,ZmPHYB1可抑制phyB-9突变体下胚轴及叶柄的伸长；ZmPHYB1可与拟南芥AtPIF5互作并诱导下游避荫反应响应基因和生长素合成基因的表达；Y98F和Y359F氨基酸的替换可增强ZmPHYB1的活性。研究结果表明ZmPHYB1在拟南芥中具有介导避荫反应的作用,同时也将为玉米耐密株型改良提供参考。

小麦TaLEA3基因家族的全基因组鉴定及其响应赤霉病的表达模式分析
郑彤,袁敏敏,花辰,周瑶,李磊,孙政玺,李韬
2019 Vol. 9 (4): 357-368. DOI:10.19586/j.2095-2341.2019.0059
摘要 ( ) PDF (13755KB)( )
胚胎晚期丰富（late embryogenesis abundant，LEA）蛋白是高等植物胚胎发育后期种子中大量积累的一类蛋白质，在植物逆境胁迫方面具有重要作用。其中第三组的LEA蛋白（LEA3）是该类蛋白家族的主要成员，因其在植物抗旱耐盐性方面的卓越表现而被广泛研究。在前期研究中，通过高通量蛋白质组学的方法，在禾谷镰刀菌接种的小麦穗轴中筛选到1个与抗病相关的差异积累蛋白Wrab17（LEA3基因家族）。为了揭示小麦中TaLEA3基因家族的序列特征及其对生物胁迫的响应机制，采用生物信息学方法对该基因家族进行了系统研究。结果表明，在小麦全基因组中共鉴定到26个TaLEA3基因，命名为TaG3LEA-1~TaG3LEA-26，分布于小麦的9条染色体上。串联重复和片段复制是该基因家族扩张的主要方式；MEME分析表明该家族成员含有motif 2或motif 5，是LEA3家族的典型特征。通过基因表达分析和qRT-PCR验证，发现TaG3LEA-25在干旱和高温胁迫下均高表达，并且在不同赤霉病抗感材料间存在显著差异，推测其可能参与了小麦赤霉病抗性调控。研究结果为阐明小麦TaLEA3家族基因的进化关系提供了有价值的信息，并且为进一步探究其功能机制奠定了理论基础。

无菌斑马鱼感染鲤春病毒血症病毒模型的建立
谢亚东,解明旭,李解,王安然,杨培龙,冉超,周志刚
2019 Vol. 9 (4): 369-374. DOI:10.19586/j.2095-2341.2019.0020
摘要 ( ) PDF (1992KB)( )
我国水产养殖业受病毒危害严重，但目前尚无有效的应对手段。近年来研究证实，肠道菌群是宿主和病毒互作的参与者，然而鱼类的相关研究较少。无菌动物感染模型是研究肠道菌群相关功能的前提。基于此，以模式生物斑马鱼为研究对象，建立了稳定的无菌斑马鱼鲤春病毒血症病毒（spring viraemia of carp virus，SVCV）感染模型，并利用该感染模型探究斑马鱼肠道菌群和3株代表性的肠道土著菌对病毒感染的影响，包括鲸杆菌（Cetobacterium somerae）、维氏气单胞菌（Aeromonas veronii）及类志贺邻单胞菌（Plesimonas shigelloides）。研究结果显示，经菌鱼互作24 h，未观察到肠道菌群和代表菌株对病毒感染的影响。无菌斑马鱼病毒感染模型的建立为快速筛选影响病毒感染的菌株提供了一条新的途径，并为进一步探寻和开发细菌的潜在抗病毒效应元件提供了可能。

吉陶单极虫可分泌蛋白酶基因的克隆与生物信息学分析
张凤丽,杨雅麟,夏锐,高辰辰,李栋,冉超,张震,张洪玲,周志刚
2019 Vol. 9 (4): 375-383. DOI:10.19586/j.2095-2341.2019.0018
摘要 ( ) PDF (4896KB)( )
粘孢子虫为鱼类主要的寄生虫，给渔业的生产造成严重的危害。近年来，粘孢子虫的蛋白酶以及抑制剂在入侵和感染宿主中的作用被越来越多的报道。在前期粘孢子虫吉陶单极虫转录组数据的基础上，成功克隆了3个可分泌蛋白酶基因： TK Papain-1、TK Papain-2和TK Pepsin，并且通过异源表达得到了与预测蛋白大小相符的蛋白。通过生物信息学的分析发现，TK Papain-1、TK Papain-2属于Papain (C1A)家族成员，均编码半胱氨酸蛋白酶，分别编码150个和322个氨基酸，蛋白大小为17.06 kDa和36.7 kDa；TK Pepsin编码天冬氨酸蛋白酶，编码491个氨基酸，编码蛋白理论大小为55.41 kDa。3个可分泌蛋白酶均有信号肽序列，为可分泌蛋白；通过进化树的构建，发现与海葵、水螅、纤毛虫同源序列亲缘关系较近。通过多序列比对，找到了可分泌蛋白酶的保守位点。研究结果为进一步深入粘孢子虫蛋白酶性质及感染机制方面的研究提供了基础。

除草剂2,4-D降解菌株的分离、筛选与鉴定
栗旭阳,黄丽玲,郭倩楠,高如雨,张维,陈明,陆伟,周正富
2019 Vol. 9 (4): 384-395. DOI:10.19586/j.2095-2341.2019.0025
摘要 ( ) PDF (4663KB)( )
2,4-二氯苯氧乙酸（2,4-dichlorophenoxyacetic acid，2,4-D）是一类广泛应用于单子叶作物田间杂草防除的除草剂，但其大量施用导致的环境残留已对生态环境造成严重威胁。通过富集培养的方法，从2,4-D污染土壤样品中筛选分离到85株耐受菌，16S rDNA分析显示其分属假单胞菌属（Pseudomonas）、芽孢杆菌属（Bacillus）、赖氨酸杆菌属（Lysinibacillus）、类芽孢杆菌属（Paenibacillus）、短杆菌属（Brevibacillus）、沙雷氏菌属（Serratia）、甲基杆菌属（Methylobacterium）、贪铜菌属（Cupriavidus）、红球菌属（Rhodococcus）、拉恩氏菌属(Rahnella)、葡萄球菌属（Staphylococcus）、阿氏肠杆菌属（Enterobacter）和分支杆菌属（Mycobacterium）。其中一株假单胞菌属细菌2,4-D最高耐受浓度达8 g/L。选取部分菌株以2,4-D为唯一碳源培养，通过检测2,4-D降解产物（4-aminoantipyrine显色测量和高效液相色谱）测定菌株的降解能力，并利用质谱（LC/MS、LC-QTOF）检测其代谢产物。共确定11株菌株具有较高的2,4-D降解能力，其中菌株L1、L2、L4和L6在培养72 h后2,4-D的利用率分别为17.3％、28.07％、38.97％和49.02％；LC/MS和LC-QTOF分析检测表明上述菌株将2,4-D脱去侧链基团转化为酚类物质，推测其降解主要为2,4-二氯苯酚（2,4-DCP）途径。

水性涂料中微生物群落结构及其多样性分析
马永凯,陶宏兵,李文茹,谢小保,施庆珊,周少璐
2019 Vol. 9 (4): 396-403. DOI:10.19586/j.2095-2341.2018.0135
摘要 ( ) PDF (7342KB)( )
随着中国涂料行业的高速发展，水性涂料的需求量与日俱增，然而对于水性涂料中微生物群落结构及其多样性的分析较少。以广东省某厂家提供的4种不同水性涂料样品（YH4、XJ1、XJ2和YH3）为研究对象，利用16S rRNA高通量测序技术检测并分析其微生物群落结构及多样性。结果表明，从4个水性涂料样本中共获得有效序列171 822条，涵盖了30门66纲98目174科340属的细菌；物种分类树与微生物组成分析显示变形菌门、厚壁菌门与拟杆菌门为优势菌群，其中，变形菌门在涂料样本YH4、XJ1、XJ2和YH3中的相对丰度分别为97.75%、62.53%、99.76%和75.80%；Beta多样性分析表明样本YH4和XJ2微生物群落多样性较为相似。研究解析了水性涂料中微生物群落结构、相对丰度及多样性，对建立和完善水性涂料中微生物防控体系具有一定的指导意义。

壳聚糖薄膜培养对脐带间充质干细胞抗炎基因表达的影响
徐雄峰,邱波,李华杰,易鹏
2019 Vol. 9 (4): 404-408. DOI:10.19586/j.2095-2341.2019.0021
摘要 ( ) PDF (3831KB)( )
为了比较壳聚糖薄膜培养和常规平板培养对间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）抗炎相关基因表达的差别，从脐带中分离MSCs并分别进行壳聚糖薄膜培养和常规平板培养。采用Real-time PCR和Western blot、免疫荧光技术方法检测MSCs抗炎相关基因LIF、IL6ST、IL-10、TSG6、COX-2、STC-1、IL1RN、IL-4、IL-13 mRNA及其蛋白的表达。结果显示，壳聚糖薄膜培养的MSCs形态为类球形体，壳聚糖薄膜培养的MSCs抗炎相关基因LIF、IL6ST、IL-10、TSG6、COX-2、STC-1、IL1RN、IL-4、IL-13 mRNA及其蛋白的表达水平较普通平板培养组显著增加，差异有显著统计学意义（P<0.01）。研究结果表明，与常规培养的MSCs比较，壳聚糖薄膜培养的MSCs能形成多细胞球体，抗炎相关基因的表达显著升高。

技术与方法

Klenow（exo-）蛋白的制备及其在RAA检测体系中的应用研究
付玉和,孙文丽,黄震巨,程奇,
2019 Vol. 9 (4): 409-415. DOI:10.19586/j.2095-2341.2018.0120
摘要 ( ) PDF (2906KB)( )
为了建立一种Klenow(exo-)蛋白的制备方法，并对其在RAA（recombinase-aid amplification）技术中的应用进行初步研究,通过Overlap点突变法构建获得目的基因片段，并构建Klenow（exo-）蛋白表达载体进而转化至大肠杆菌BL21(DE3)菌株进行诱导表达。表达产物通过Ni-NTA螯合层析进行初步纯化，然后用Heparine柱层析进一步纯化，通过SDS-PAGE鉴定纯化产物，获得了纯度较高的目的蛋白。用纯化后的目的蛋白配制RAA反应体系，针对肉源实际样本设计突变位点进行检测。实验结果显示该体系具有较强的特异性，在模板基因序列3′端出现双碱基差异时不会进行有效扩增，相较于常规的PCR检测方式该体系能够实现双碱基差异位点的有效区分。该技术未来有望大规模应用于SNPs的检测。

1型肺炎兔抗血清的制备及其在多糖含量检测中的质控研究
赵云霞,江魁,郭爱英,李景艳
2019 Vol. 9 (4): 416-421. DOI:10.19586/j.2095-2341.2019.0011
摘要 ( ) PDF (2055KB)( )
建立一种新的1型肺炎兔抗血清制备方法，并进行型别特异性和方法专属性分析后，用于1型肺炎球菌多糖结合及结合疫苗制备过程中多糖含量的测定。以确定的免疫程序，用自制肺炎1型多糖结合物免疫新西兰白兔，采血后分离血清，免疫血清以免疫双扩散法和 ELISA 法与商品诊断血清比较；以速率比浊法分析型特异性和方法专属性。建立了自制家兔兔抗血清的制备方法，且该血清优于商品诊断血清，可达到速率比浊法型特异性和相应方法专属性要求，该方法可用于对1型肺炎球菌结合物及结合疫苗多糖含量测定。研究结果为肺炎球菌结合疫苗中多糖含量的检测提供了有力的保障。

金针菇菌渣和醋渣固态发酵的工艺研究
费凡,冯伟伟,茆广华,张伟杰,丁阳阳,赵婷,吴向阳
2019 Vol. 9 (4): 422-429. DOI:10.19586/j.2095-2341.2019.0023
摘要 ( ) PDF (1231KB)( )
为了探索金针菇菌渣和醋渣2种农业废弃物资源化利用的方式，采用固态发酵法对金针菇菌渣和醋渣进行发酵。通过单菌发酵实验和多菌发酵实验探究其固态发酵的最佳方式及菌种组成，并摸索其最优的原料配比和发酵时间，随后通过单因素实验对发酵温度、接种量和pH进行优化，并在此基础上设计三因素三水平的正交实验以进一步优化发酵工艺。研究表明，金针菇菌渣和醋渣固态发酵的最佳发酵方式为多菌发酵，且混合菌种的组成及比例为枯草芽孢杆菌∶黄孢原毛平革菌∶热带假丝酵母=1∶1∶1；发酵原料金针菇菌渣和醋渣的配比为7∶3，发酵3 d，粗蛋白质含量达到峰值；单因素实验和正交实验的结果显示其最佳发酵条件为发酵温度26℃、接种量7%以及pH 7.5，在该条件下发酵3 d，发酵产物中的粗蛋白质含量为17.90%。研究结果为农业废弃物资源化高效利用提供了一种新途径。