本期目录
生物技术进展
2019年 第9卷 第3期
发布日期：2019-05-25
进展评述
氢分子在临床应用中的研究进展
寻治铭,赵清辉,琚芳迪,何晋,姚婷婷,赵鹏翔,马雪梅,谢飞
2019 Vol. 9 (3):
217-222.
DOI:10.19586/j.2095-2341.2019.0006
摘要 (
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氢分子是一种具有弱还原性的双原子分子。近年来研究发现，氢分子具有广泛的生物学效应，氢分子的抗炎、抗氧化作用在大量动物疾病模型及临床试验中得到证实。目前已发现氢分子在超过200种疾病中均显示出一定的治疗效果，并在初步的临床试验中取得了相似的结果。主要对氢分子在肿瘤、代谢相关疾病、神经系统疾病以及其他氧化应激及炎症相关疾病中的临床应用进展进行了综述，以期为研究人员进行大规模、多中心临床研究以及对氢分子更深层次的作用机制研究提供参考。
胶质母细胞瘤免疫治疗研究进展
刘梦昱,谢飞,张鑫,赵鹏翔,
2019 Vol. 9 (3):
223-230.
DOI:10.19586/j.2095-2341.2019.0034
摘要 (
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免疫治疗旨在提高机体对肿瘤的免疫应答。如今所采用的主要手段包括提高机体部分的免疫应答或针对靶向抗原刺激机体产生相应的免疫应答。其中，后者通常将重新启动免疫应答的细胞引入体内使免疫系统直接作用于靶标抗原。临床上，主要将免疫治疗应用于黑素瘤和前列腺瘤等实体瘤的治疗中。中枢神经系统曾被认为是免疫特免区，然而近年来大量的研究表明脑部的免疫系统处于高水平活化状态并能够与脑部肿瘤相互作用。因此，研究并利用这种免疫作用对于恶性脑部肿瘤的治疗十分重要。针对近年来恶性胶质母细胞瘤的免疫治疗进展进行了总结，并对中枢神经系统和胶质母细胞瘤的免疫机制、免疫治疗疫苗及T细胞疗法在肿瘤治疗中的研究进行了详细的介绍，以期为发展出更为有效的靶向治疗手段进而大幅提高GBM患者的生存时间带来新的思路。
EBV与TLRs信号通路相互作用机制研究进展
张旭娟,赵鹏翔,YAO Mawulikplimi Adzavon,李秦剑,谢飞
2019 Vol. 9 (3):
231-239.
DOI:10.19586/j.2095-2341.2019.0015
摘要 (
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EB病毒（Epstein-Barr virus，EBV）作为全球范围内高感染率的病毒之一，与鼻咽癌、胃癌、乳腺癌及宫颈癌等众多肿瘤的发生有关。Toll样受体（Toll like receptors，TLRs）作为先天免疫系统的组成成分，在机体抵御病毒的过程中发挥着重要作用。当机体受到EBV刺激，可通过激活TLRs信号通路引发固有免疫应答，从而控制EBV的进一步感染，但EBV也可通过一系列途径调控宿主免疫，维持其自身在宿主内的持续性感染。因此，研究EBV与固有免疫TLRs信号通路之间的相互作用机制，对于进一步阐明EBV的潜伏感染、裂解感染的调控机理及其致病性具有重要意义。主要阐述了EBV与TLRs信号通路之间相互作用的研究进展，以期为开发新的EBV治疗靶点以及完善TLRs激动剂的临床方案提供一定的参考。
自组装铁蛋白在纳米疫苗领域的应用进展
魏珍珍,刘兴健,王朋,张志芳,易咏竹
2019 Vol. 9 (3):
240-245.
DOI:10.19586/j.2095-2341.2018.0139
摘要 (
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自组装蛋白在真核细胞及原核细胞中是普遍存在的，其对生命体的正常运转具有重要意义，甚至关系到生命体的进化。常见的自组装蛋白包括病毒颗粒（virus particles）、血清白蛋白（serum albumin）、丝蛋白（silk protein）及铁蛋白（ferritin）。其中，铁蛋白可形成粒径均一、生物相容性良好的纳米材料，还具有独特的理化性质，如pH敏感、高温耐受、大多数变性剂耐受，即可通过调节pH来控制铁蛋白的自组装特性。铁蛋白是存在于大多数生物体内的天然蛋白，在肿瘤的诊断成像及治疗、药物载体和纳米疫苗等领域具有广阔的应用前景。重点探讨了铁蛋白的仿生合成及其在纳米疫苗领域的应用进展，以期为新型动物纳米疫苗的研发提供参考。
蛋白N-糖基化分析方法研究进展
张小倩, 张腾腾,闫攀,杨毕超,安凤霞
2019 Vol. 9 (3):
246-252.
DOI:10.19586/j.2095-2341.2018.0121
摘要 (
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糖基化是真核细胞最常见的蛋白转译后修饰方式之一，N-糖基化作为糖蛋白中最主要的糖基化类型，在许多生命活动中起重要作用，对糖蛋白N-糖链的定性及定量研究具有重要意义。常规N-糖基化分析策略多是将其从肽链上酶切游离后再分析，但N-糖链为多羟基醛类化合物，经典反相色谱与紫外检测方式对其分离分析较困难。针对这种情况，科学家多是通过柱前衍生法使糖链带上紫外或荧光基团，增加检测灵敏度。对近年来科学家分离分析游离N-糖链的方法做了归纳与总结，其中毛细管电泳、高效液相色谱以及质谱联用技术在N-糖链的分离分析上有着巨大优势，对糖蛋白上N-糖的定性定量、结构表征具有重要意义。与此同时应进一步发展稳定可靠的N-糖释放、富集方法，并结合现代高效的分析手段，以及有针对性的N-糖解析措施，以期为N-糖基化高通量、高准确性的分析提供依据。
研究论文
人源化Mesothelin嵌合抗原受体介导的T细胞抗肿瘤效果
刘圆圆,牛卿,冯晓明
2019 Vol. 9 (3):
253-261.
DOI:10.19586/j.2095-2341.2019.0028
摘要 (
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CAR-T细胞（嵌合抗原受体T细胞）在治疗血液肿瘤领域已取得了显著的效果，但在实体瘤中的治疗应用仍存在很多阻碍。间皮素（Mesothelin）是肿瘤相关抗原，在间皮瘤、卵巢癌、胰腺癌等肿瘤细胞表面过表达，当前大多以Mesothelin为靶点的研究使用小鼠来源的scFv（单链可变识别区）进行基因编辑构建表达载体，在模拟人类疾病方面显示出诸多不足，为研究转化到临床治疗中带来障碍，因此进行人源化的研究非常必要。构建表达人源化anti-mesothelin的scFv（命名为P4）联用人41-BB共刺激结构域的P4 CAR表达载体，制备表达P4 CAR的慢病毒，感染人CD3+T细胞，成功制备了稳定且高表达水平的P4 CAR-T细胞。PCR检测表明人宫颈癌肿瘤细胞系HeLa中表达Mesothelin。体外实验表明，P4 CAR-T细胞能有效杀伤HeLa细胞；在NSG小鼠中进行体内实验，相比对照组，注射P4 CAR-T细胞组中已形成的肿瘤生长延缓，荷瘤小鼠的生存期也得到延长。研究结果说明，P4 CAR-T细胞对于Mesothelin阳性的肿瘤具有潜在的治疗效果，为进一步改善体内治疗效果及临床治疗的增效策略研究提供了基础。
不同转染方法包装慢病毒感染人白血病细胞的比较研究
张明英,袁佳佳,张晓茹,邢文,白洁,周圆
2019 Vol. 9 (3):
262-270.
DOI:10.19586/j.2095-2341.2019.0016
摘要 (
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白血病研究中常需要在细胞中进行慢病毒介导的基因过表达或者敲降，但慢病毒生产方法存在成本高、对悬浮细胞感染效率低等问题。为解决这些问题，通过比较利用线性聚乙烯亚胺（linear polyethylenimine，LPEI）和脂质体两种转染方法包装成的慢病毒对白血病细胞的感染能力，以及感染后对细胞生物学特性的影响，确定不同转染方法在白血病实验研究中的有效性和安全性。在相同条件下利用LPEI和脂质体产生慢病毒颗粒，比较发现用LPEI转染法包装的慢病毒滴度略高。根据病毒感染复数和慢病毒滴度分别感染3种白血病细胞系（K562、HL60和HEL），两种方法间感染白血病细胞系效率无差别。在感染不同细胞系时两种不同转染方法对细胞增殖略有影响，但对其他生物学特性比如细胞诱导分化和克隆形成能力的影响是一致的。因此在白血病相关研究中，转染试剂LPEI包装慢病毒方法可以成为更加经济实用的选择。
利用生物信息学方法解析自噬相关基因在人体红细胞终末分化各阶段的动态表达
徐长禄,赵艳红,马艺戈,王冰蕊,王鼎,郭青,佟静媛,高洁,李亚朴,刘金花,石莉红
2019 Vol. 9 (3):
271-276.
DOI:10.19586/j.2095-2341.2018.0111
摘要 (
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为了探究自噬相关基因在人体红细胞终末分化各阶段的表达概况，利用生物信息学方法对人体终末分化各阶段红细胞转录组测序（RNA sequencing，RNA-Seq）数据中自噬相关基因的表达进行提取并分析。结果表明，自噬相关基因在红细胞终末分化各阶段呈现不同的表达模式；在红细胞终末分化的早期，超过50%的自噬相关基因呈现高表达状态；原始红细胞及早幼红细胞中高表达的自噬相关基因富集的生物学过程主要包括细胞自噬及其调节、蛋白质的磷酸化及囊泡的运输，而线粒体自噬相关基因主要在中幼红细胞及晚幼红细胞阶段高表达。研究发现，自噬相关基因在人体红细胞终末分化各阶段的表达呈现动态变化；不同阶段的红细胞中高表达的自噬相关基因及其富集的生物学过程均不同。
维甲酸对胎鼠骨骼致畸作用的研究
韩继卫,李秋霞,夏鹏,孙苗,王冰烃,郑大恒
2019 Vol. 9 (3):
277-282.
DOI:10.19586/j.2095-2341.2019.0044
摘要 (
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维甲酸是动物体内维生素A的代谢中间产物，在脊椎动物生长发育，尤其是胚胎发育过程中有重要作用。研究了维甲酸在不同剂量及不同胚胎发育时间点对骨骼发育的影响,并通过检测Cyp26b1基因的表达水平初步探究了维甲酸致畸作用的机制。结果显示，维甲酸导致的骨骼致畸程度与剂量呈依赖关系；孕期内维甲酸暴露时间不同，致畸部位也不同；维甲酸能够引起胎鼠Cyp26b1基因的表达下降。维甲酸暴露可导致骨骼发育畸形，这一作用可能是通过Cyp26b1基因的表达变化引起的。
常规籼稻黄华占籽粒淀粉和蔗糖代谢相关酶活性对夜温升高的响应
张文倩,王亚梁,朱德峰,陈惠哲,向镜,张义凯,武辉,胡国辉,易子豪,张玉屏
2019 Vol. 9 (3):
283-289.
DOI:10.19586/j.2095-2341.2019.0010
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为了揭示夜间温度升高对灌浆过程中籽粒灌浆生理过程的影响规律，采用人工气候箱模拟自然环境的温度变化，在水稻灌浆的3个时期P1（水稻开花后的前10 d）、P2（水稻开花后11~20 d）和P3（水稻开花后21~30 d），均设置21℃（T1）、25℃（T2）和29℃（T3）3种不同的夜间温度处理，日间最高温度为32℃，研究水稻灌浆期间，不同灌浆时段夜温升高对水稻籽粒淀粉和蔗糖含量及其代谢相关酶活性的影响。结果表明，水稻开花后的P1时期和P2时期籽粒淀粉和蔗糖代谢相关酶活性受夜温升高的影响较大，其中P1时期是淀粉代谢对夜温变化最敏感的时期。灌浆初期（P1），夜温升高，淀粉含量显著上升，直链淀粉和支链淀粉的含量也随之上升，蔗糖含量下降；蔗糖合成酶、可溶性淀粉合成酶和淀粉分支酶活性下降，蔗糖磷酸合成酶日间酶活性上升而夜间下降，这说明夜温升高对酶活性的影响具有持续效应，即日间酶活性也会受到夜温升高的影响。研究结果为明确水稻籽粒灌浆过程中气候变化对籽粒物质积累的影响机制提供了参考。
2株乳杆菌全发酵培养物及其组分的抗氧化能力分析
钟丘实,李莉,陈新丹,张京,徐维娜,徐建雄
2019 Vol. 9 (3):
290-295.
DOI:10.19586/j.2095-2341.2018.0115
摘要 (
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为了研究植物乳杆菌Lactobacillus plantarum CGMCC 1.557和干酪乳杆菌Lactobacillus casei CGMCC 1.570的全发酵培养物及其组分的抗氧化能力，分别制备2株菌的全发酵培养物、发酵上清液、菌体悬浮液及胞内提取物，随后测定其对3种自由基（DPPH·、O2·-、·OH）的清除率以及其中3种抗氧化酶的活性，包括总超氧化物歧化酶（total superoxide dismutase，T-SOD）、过氧化氢酶（catalase，CAT）、谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px），进而评价2株菌的全发酵培养物及其组分的抗氧化能力。结果表明，植物乳杆菌和干酪乳杆菌的全发酵培养物都具有较强的清除自由基的能力和较高的T-SOD、GSH-Px活性；2株菌的发酵上清液对DPPH·、O2·-的清除率和T-SOD活性显著高于菌体悬浮液和胞内提取物（P<0.05）；2株菌的菌体悬浮液对·OH的清除率显著高于其他组分（P<0.05）。研究表明，植物乳杆菌L. plantarum CGMCC 1.557和干酪乳杆菌L. casei CGMCC 1.570都具有较高的抗氧化能力，而其抗氧化能力主要源于发酵上清液和菌体，研究结果为进一步开发抗氧化乳杆菌产品提供了理论依据。
粪肠球菌β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶基因的克隆表达及酶学性质表征
陈宝莉,秦臻,赵黎明
2019 Vol. 9 (3):
296-302.
DOI:10.19586/j.2095-2341.2019.0022
摘要 (
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N-乙酰氨基葡萄糖因其重要的功能活性而具有广阔的应用前景，β-N-乙酰氨基葡萄糖苷是酶法制备N-乙酰氨基葡萄糖领域一类重要的糖苷水解酶。从粪肠球菌（Enterococcus faecalis）基因组中克隆得到一个GH20家族β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶基因（EfNagase），并在大肠杆菌中进行了异源表达，研究了重组酶的酶学性质。序列分析发现EfNagase与已报道的Streptococcus pneumoniae TIGR4来源的β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶序列相似度最高，为52.08%。对其酶学性质研究发现纯化后的EfNagase比活力为3 606.10 U/mg，在温度50℃、pH 6.0的条件下活性最高，且在温度低于50℃、pH 3.5~11.5的范围内展现出较高的稳定性（残余酶活>90%）。β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶是酶法制备N-乙酰氨基葡萄糖中重要的一类糖苷水解酶。研究发现EfNagase具有高酶活、高热稳定性和严格的底物特异性，在酶法制备N-乙酰氨基葡萄糖领域具有良好的应用潜力。
技术与方法
棉花线粒体基因cRT-PCR改良及其在寻找CMS相关基因中的应用
王裴林,周利利,梁成真,孟志刚,郭三堆,张锐
2019 Vol. 9 (3):
303-308.
DOI:10.19586/j.2095-2341.2018.0134
摘要 (
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植物线粒体是含有遗传物质的细胞器，为细胞生命活动提供必需的能量。农业生产中，线粒体基因的变异容易导致细胞质雄性不育，为作物杂交育种提供了高效的杂交母本。然而，植物线粒体基因组结构复杂，不同类型的细胞质雄性不育的发生往往由特异的基因突变所导致，为雄性不育基因的克隆带来了较大的困难。针对棉花线粒体基因的特性，改进了cRT-PCR技术，RNA连接酶将线粒体mRNA的5′和3′末端连接环化后，应用随机引物进行反转录，在保证与特异引物获得相同的完整线粒体基因转录本的基础上，实现了同时对所有线粒体编码基因的cRT-PCR，方便对线粒体编码基因的结构进行全局分析，并且通过改良方法对棉花CMS基因进行探索，从而快速找到异常因素，为线粒体功能基因组分析提供了新的方法。
Bradford定量法在蛋白质组学中应用的优化研究
崔为同,薛华儒,成洪达,张海滨,王清路
2019 Vol. 9 (3):
309-315.
DOI:10.19586/j.2095-2341.2018.0126
摘要 (
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PDF
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Bradford法具有成本低、灵敏度高和测定快速简便的特点，是目前应用最广泛的蛋白质定量方法之一。为使Bradford法更适合在蛋白质组学研究中应用，针对双向电泳样品对经典Bradford法进行了优化。通过分析0~1 000 μg范围内蛋白质含量与吸光度的关系，确定Bradford法的线性范围在0~100 μg之间。通过分析不同体积蛋白质裂解液（lysis）、lysis各组分以及不同表面活性剂的干扰程度，发现lysis的干扰程度与其体积呈正相关；通过在有无lysis两种条件下连续测定蛋白质样品吸光度的变化，发现lysis会降低蛋白质-染料复合物的稳定性，较适宜的测定时间为反应后3~30 min；将显色液中磷酸含量提高至10.2%（w/V）可提高蛋白质-染料复合物的稳定性。由于相同含量蛋白质样品在有无lysis两种条件下，吸光度值有较大差异，因此在制作标准曲线时，在标准蛋白样品和对照中都应加入相应体积的lysis。通过将加样体积从100 μL减小为10 μL并比较不同加样体积所得标准曲线，发现加样体积调整可减小数据波动性，改善标准曲线线性关系，同时可省去对样品的稀释步骤，简化操作。
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