本期目录
生物技术进展
2019年 第9卷 第2期
发布日期：2019-03-25
植物-微生物互作专栏
植物-微生物互作专栏
小麦NTL转录因子的全基因组鉴定及其在小麦与条锈菌互作过程中的表达变化分析
王培,王凤涛,常洪雷,冯晶,郭青云,蔺瑞明
2019 Vol. 9 (2):
114-121.
DOI:10.19586/j.2095-2341.2019.0004
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NTL（NAC with transmembrane motif 1-like，NTM1-LIKE）类转录因子是NAC转录因子家族的一员，其特征是除NAC结构域外，C末端具有跨膜结构域。NTL转录因子已被证实在植物发育以及响应生物和非生物胁迫中发挥着重要作用，但小麦中NTLs的研究相对较少。基于此，对小麦中NTL类转录因子进行全基因组鉴定，并分析NTLs的系统发育、基因结构、保守基序及其在小麦与亲和条锈菌互作过程的表达变化。结果表明，在小麦中有17个NTLs，属于7个同源群，分布在12条染色体上，亚细胞定位的预测分析结果显示，NTL转录因子在细胞核、质膜、叶绿体类囊体及内质网膜都有定位信号的出现。此外，部分NTL转录因子的表达受小麦与条锈菌亲和互作的诱导。研究结果为小麦NTL转录因子家族的功能分析提供了一定的参考。
侵染滇黄精的菜豆普通花叶病毒的检测与鉴定
陈泽历,杨林毅,陈潞,孙雁,魏朝霞,李永忠,赵明富,文国松
2019 Vol. 9 (2):
122-128.
DOI:10.19586/j.2095-2341.2018.0140
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滇黄精作为一种重要的中药材，应用领域广泛。随着其市场需求量的增加，野生滇黄精已较为稀少，因而人工种植产业得到发展，但大面积的单一种植导致滇黄精病害发生较为严重。目前对于滇黄精真菌病（如叶斑病、炭疽病、黑斑病等）的研究较多，但尚未有其病毒病的报道。为了明确侵染滇黄精并引起其花叶、叶片皱缩症状的病毒病原，对采集于云南文山的滇黄精病样采用透射电子显微镜观察以及双抗体夹心酶联免疫吸附法（double antibody sandwich enzyme-linked immunosorbent assay，DAS-ELISA）、反转录PCR（reverse transcription PCR，RT-PCR）技术检测。对侵染症状明显的滇黄精病叶进行病毒粒子提纯，在电子显微镜下可观察到线状病毒粒子，大小为(670~760) nm×(9~12) nm。通过DAS-ELISA检测出3份滇黄精病样（DHJ1、DHJ2、DHJ3）汁液与菜豆普通花叶病毒（Bean common mosaic virus，BCMV）抗体呈强阳性反应。随后提取DAS-ELISA检测呈阳性的DHJ1病样的总RNA，利用马铃薯Y病毒科特异性简并引物（Sprimer/M4T）进行RT-PCR扩增，并对扩增产物进行测序分析。结果表明，所得序列长为1 609 bp，其中包含588 bp的部分核内含体蛋白b基因（NIb）、864 bp的完整外壳蛋白（coat protein，CP）基因和157 bp的3′端非翻译区（3′-untranslated region,3′-UTR）。而同源性分析显示该序列与马铃薯Y病毒科(Potyviridae)马铃薯Y病毒属（Potyvirus）的BCMV大豆分离物（KJ807813）的核苷酸序列和CP氨基酸序列的同源性分别高达99%和100%，与BCMV花生分离物（HM776124）的同源性分别为97%和99%。基于CP氨基酸序列的系统发育分析表明，该病毒与已报道的BCMV中国大豆分离物（KJ807813）、花生分离物（HM776124）亲缘关系最近，聚类为一簇。这是首次报道病毒侵染黄精属植物，将其命名为菜豆普通花叶病毒滇黄精分离物（BCMV-DHJ1），表明菜豆普通花叶病毒能自然侵染滇黄精。
进展评述
胶质母细胞瘤相关分子标志物研究进展
刘梦昱,谢飞,张鑫,赵鹏翔,
2019 Vol. 9 (2):
129-138.
DOI:10.19586/j.2095-2341.2018.0118
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胶质母细胞瘤（glioblastoma，GBM）是中枢神经系统中最常见的原发性恶性肿瘤,肿瘤患者预后差，中位生存时间仅为14个月，并且经过治疗后仍有极高的复发率。现今无法治愈GBM的重要原因之一是人们仍然缺乏对GBM耐药性在肿瘤生物学机制方面的理解。因此，全面探究GBM相关分子标记物对于研究GBM是必不可少的。对近年来研究发现的GBM相关分子标志物进行了全面的介绍，包括表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor, EGFR)、异柠檬酸脱氢酶1/2（isocitrate dehydrogenase 1/2, IDH1/2）、1p19q等以及影像学和免疫学相关分子标志物等，这些分子标志物为胶质母细胞的准确分类和精准治疗提供了理论基础，通过对以上标志物相关的肿瘤分子通路的探究，有利于发展出更为有效的靶向治疗手段，从而大幅提高GBM患者的生存时间。
功能性糖防治畜禽沙门氏菌病和大肠杆菌病的作用机制研究进展
乔宇,石波
2019 Vol. 9 (2):
139-145.
DOI:10.19586/j.2095-2341.2018.0109
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沙门氏菌和大肠杆菌是两种重要的人畜共患致病菌，严重威胁着畜禽健康、食品安全、人类健康和公共安全。伴随着集约化畜禽养殖业的快速发展，沙门氏菌和大肠杆菌造成的危害愈加显著。虽然抗生素在畜禽沙门氏菌和大肠杆菌的防治中发挥了重要作用，但抗生素的滥用导致了畜禽产品药物残留、细菌耐药性产生，并对人体具有毒性作用，因此，迫切需要在畜禽养殖中应用新型绿色饲料添加剂以替代抗生素。研究表明，糖链参与了疾病的发生和病原体感染等过程，功能性糖对沙门氏菌和大肠杆菌的防治具有较好的功效。对功能性糖抑制畜禽沙门氏菌和大肠杆菌感染及相关机制进行了综述，以期为功能性糖替代抗生素用以防治畜禽沙门氏菌病和大肠杆菌病的研究提供参考。
畜禽粪污源抗生素及耐药基因在环境中的归趋
黄荣才,高胜涛,范士杰,马露,卜登攀,
2019 Vol. 9 (2):
146-151.
DOI:10.19586/j.2095-2341.2018.0137
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抗生素因具有促进动物生长、提高饲料转化效率、预防治疗动物疾病等作用而被大量用于畜牧业。然而仅有少量抗生素可被动物吸收降解，其余大部分抗生素以原型或有抗菌活性的代谢产物的形式通过粪尿排入环境。除抗生素外，动物粪便中还含有大量的耐药细菌，是巨大的耐药基因（antibiotic resistance genes，ARGs）库。残留于动物粪便中的抗生素和耐药基因通过动物粪便的施用而在环境中传播，并且残留的抗生素能进一步富集环境中的耐药基因。这对人类健康及生态系统存在着潜在危害。基于此，对畜禽粪污源抗生素及耐药基因在环境中的归趋进行综述，以期为研究畜禽粪污源抗生素及耐药基因对生态系统及人类健康的危害提供科学参考。
研究论文
蒺藜苜蓿MtFVE基因功能初步解析
王瑞良,张鹏程,牛丽芳,朱昊,李学森,王兴春,林浩
2019 Vol. 9 (2):
152-160.
DOI:10.19586/j.2095-2341.2019.0014
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拟南芥（Arabidopsis thaliana）中自主通路成员FLOWERING LOCUS VE（FVE）主要通过表观遗传学机制抑制其下游开花抑制子FLOWERING LOCUS C（FLC）的表达从而促进开花，但有研究发现蒺藜苜蓿（Medicago truncatula）中没有FLC的同源基因，因此，蒺藜苜蓿中FVE同源基因调控开花时间的分子作用机理还有待研究。通过生物信息学方法在蒺藜苜蓿中筛选到2个拟南芥FVE的同源蛋白，将其分别命名为MtFVEa和MtFVEb。经氨基酸序列比对发现，2个蛋白均具有典型的WD40蛋白结合结构域。随后通过qRT-PCR和半定量RT-PCR检测MtFVEa和MtFVEb基因组织表达特异性，发现2个基因在花和营养生长期的茎尖具有较高水平的表达。经酵母双杂实验进一步分析发现，MtFVEa蛋白与MtFLD \[拟南芥FLOWERING LOCUS D（FLD）的同源蛋白\] 和MtHDA6 \[拟南芥histone deacetylase 6（HDA6）的同源蛋白\] 均发生蛋白互作，表明MtFVE可能同样形成FVE-FLD-HDA6三元复合体参与蒺藜苜蓿开花调控。研究结果为进一步探索蒺藜苜蓿MtFVE基因的功能提供了研究思路和理论支持。
蒺藜苜蓿赤霉素氧化酶基因MtGA20ox的功能解析
马青霞,殷鹏程,林浩,金竹萍,王欢庆,杨江平,裴雁曦,牛丽芳
2019 Vol. 9 (2):
161-168.
DOI:10.19586/j.2095-2341.2019.0009
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GA20-氧化酶（GA20-oxidase，GA20ox）是赤霉素（gibberellic acid，GA）合成过程中的关键限速酶。为了对蒺藜苜蓿（Medicago truncatula）中GA20ox基因的功能进行研究，利用生物信息学的方法对蒺藜苜蓿和拟南芥（Arabidopsis thaliana）的GA20ox家族成员进行氨基酸序列比对并构建系统进化树。结果表明，与拟南芥AtGA20ox高度同源的蒺藜苜蓿MtGA20ox有3个，分别为MtGA20ox1、MtGA20ox7和MtGA20ox8，均含有保守的2OG-FeⅡ_Oxy结构域。进一步通过RT-PCR检测MtGA20ox1、MtGA20ox7和MtGA20ox8在不同组织中的表达，结果显示它们的表达都具有组织特异性。同时，亚细胞定位结果表明MtGA20ox1、MtGA20ox7和MtGA20ox8蛋白定位于细胞核和细胞质。为了对MtGA20ox的功能进行深入解析，筛选获得了逆转座子Tnt1插入MtGA20ox7的2个突变体和插入MtGA20ox8的1个突变体，并分别对3个插入突变体进行表型观察和数据统计，发现其与野生型相比株高无明显变化，这可能是由于这3个MtGA20ox基因存在功能冗余。研究结果对深入研究苜蓿中GA20ox的功能以及进一步研究赤霉素对株高的调控具有一定的参考价值。
拟南芥隐花色素CRY2调控因子PRP8基因的功能分析
郭亚蓉,王艳艳,刘军,裴雁曦
2019 Vol. 9 (2):
169-177.
DOI:10.19586/j.2095-2341.2019.0007
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植物通过光受体感受外界环境的光信号来调节自身的生长发育。隐花色素CRY1和CRY2是拟南芥（Arabidopsis）中主要的蓝光受体, 其中CRY2在蓝光条件下发生降解，但其分子机制尚不清楚。通过筛选EMS诱变的突变体库，获得了一个早花突变体。该突变体中CRY2蛋白大量积累但CRY1蛋白水平不受影响，因此将它命名为mac1(more abundant of cry2 1)。图位克隆与CRISPR-Cas9敲除实验表明，MAC1是PRP8基因的等位基因，该突变体被命名为prp8-11。定量PCR结果显示，CRY2 mRNA表达量在prp8-11突变体中低于野生型中的表达量。这说明CRY2蛋白降解变慢不是由于基因表达增多引起的。研究结果为进一步了解PRP8基因的功能及其在光信号网络系统中的作用提供了依据。
中华根瘤菌NP1中反硝化基因启动子分析及荧光定量PCR验证
张宇,王森,陈度宇,许雷
2019 Vol. 9 (2):
178-184.
DOI:10.19586/j.2095-2341.2018.0058
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目前，在污水脱氮过程中N2O的释放量逐年上升，造成温室效应，引起酸雨并破坏臭氧层。为了研究在反硝化过程中N2O释放的机制，利用生物信息学软件在线预测了中华根瘤菌NP1反硝化过程中4个关键酶基因的启动子信息。经预测，反硝化过程所需的4个关键酶基因的表达并非传统观念上认为的使用同一个启动子，而是4个不同的启动子。同时还发现，硝酸盐还原酶和亚硝酸盐还原酶的启动子转录活性较强，而一氧化氮还原酶和氧化亚氮还原酶的启动子则转录活性较弱。为进一步探究上述预测结果，我们利用荧光定量PCR检测中华根瘤菌NP1中以KNO3为唯一氮源培养时，反硝化4个关键酶基因转录水平上的差异，以及测量反硝化过程中产生的代谢产物含量。发现硝酸盐还原酶基因和亚硝酸盐还原酶基因的转录水平明显高于一氧化氮还原酶基因和氧化亚氮还原酶基因，在反硝化过程中确实有一定量的N2O气体积累，推测可能与不同启动子的强弱有关。因此，可通过改造操纵子等基因工程手段调节反硝化关键酶的表达，使N2O全部还原为N2后再释放到空气中，构建更加高效绿色的污水脱氮菌株，具有深远的社会意义。
一株特异腐质霉纤维素酶高产突变株的鉴定分析
陈媛,李金阳,张宇宏,刘波,张志伟,徐欣欣,张伟
2019 Vol. 9 (2):
185-190.
DOI:10.19586/j.2095-2341.2019.0012
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高温真菌特异腐质霉（Humicola insolens）具有强大的纤维素酶分泌和纤维素降解能力，因此在生物质能源、饲料和纺织工业等领域中具有良好的应用前景。在特异腐质霉T-DNA随机插入突变体库中筛选得到一株纤维素酶高产菌株T53。在纤维素诱导培养条件下，突变株T53发酵上清中的滤纸酶活力、内切β-1,4葡聚糖酶活力、纤维二糖水解酶活力、β-葡萄糖苷酶活力以及木聚糖酶活力较野生型菌株分别提高了40%、60%、90%、10%、60%。蛋白电泳结果显示，T53菌株的胞外总蛋白特别是纤维素酶与半纤维素酶的分泌量较野生型菌株有显著提高。TAIL-PCR克隆鉴定了T53菌株中的T-DNA插入位点侧翼序列，结果表明T-DNA插入位点位于一个可能的C2H2型锌指蛋白类转录因子编码基因的上游启动子区域。这为揭示突变株T53中纤维素酶的高产分子机制奠定了重要基础，有助于理解特异腐质霉中纤维素酶的表达调控机制，为特异腐质霉纤维素酶高产工程菌的构建奠定了理论和技术基础。
辉光放电等离子体对葡萄汁中棒曲霉素的降解作用
马亚云,龙海涛,杜明远,薛华丽,南米娜,付国瑞,毕阳,蒲陆梅
2019 Vol. 9 (2):
191-199.
DOI:10.19586/j.2095-2341.2018.0106
摘要 (
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为了提高葡萄汁的安全品质，利用辉光放电等离子体（glow discharge plasma，GDP）反应器处理含棒曲霉素（patulin，PAT）的葡萄汁，并通过单因素试验和正交实验确定了最佳工艺条件：电压560 V、时间3 min、PAT初始浓度3 mg/L以及以100 mg/L H2O2为催化剂，在此条件下，GDP对葡萄汁中PAT的降解率高达98.9%。降解动力学测定结果表明GDP对葡萄汁中PAT的降解反应符合一级动力学特征。此外，葡萄汁经GDP处理后，对其各项理化指标进行评价，结果表明，GDP处理对葡萄汁的还原糖、可溶性固形物（total soluble solid，TSS）、总酸、pH、总酚及总黄酮均无显著影响，且可在一定程度上提高葡萄汁的澄清度。研究结果为辉光放电等离子体技术应用于葡萄汁中棒曲霉素的降解提供了理论依据。
陇西腊肉加工过程中优势乳酸菌的分离及其发酵性能研究
邓展瑞,贠建民,郭娟,牛耀星,李彦虎
2019 Vol. 9 (2):
200-209.
DOI:10.19586/j.2095-2341.2018.0098
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陇西腊肉是一种传统发酵风味肉制品。以陇西腊肉为材料，通过经典形态学分类和生理生化鉴定，对其加工过程中的优势乳酸菌（lactic acid bacteria，LAB）进行分离、鉴定。通过测定菌株的产酸能力、生长特性、耐氯化钠和亚硝酸钠能力以及产气、产黏液、产蛋白酶和脂肪酶的能力等，筛选具有优良发酵性能的菌株。随后，开展人工接种优良菌株的模拟腊肉加工试验，分析其对腊肉感官品质的影响。结果表明，从陇西腊肉中筛选获得7株乳酸菌，根据菌种形态学分类，初步鉴定分别为植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）、米酒乳杆菌（L. sake）、乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）、戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus）、肠膜明串珠菌（Leuconostoc mesenteroides）、食品乳杆菌（L. alimentarius）和弯曲乳杆菌（L. curvatus），其中，菌株R-1（植物乳杆菌）产酸能力强、生长速度快，对氯化钠和亚硝酸钠均具有较好的耐受性。经模拟腊肉发酵试验发现，添加菌株R-1后，陇西腊肉的风味得到了较大改善，表现出更好的感官可接受性。研究表明，植物乳杆菌R-1具有优良的发酵性能，可作为传统陇西腊肉工艺现代化改造的菌株来源。
全豆乳液体发酵制备纳豆激酶工艺优化
倪楠,辛志宏,张丽静,王凤忠,李淑英
2019 Vol. 9 (2):
210-215.
DOI:10.19586/j.2095-2341.2018.0138
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纳豆激酶具多效溶栓作用，是一种理想的预防和治疗血栓的天然药物。液体发酵可提高纳豆激酶产量。以纳豆枯草芽胞杆菌为出发菌株，豆乳为发酵基质，纳豆激酶活力为核心评价指标，出渣率和终点pH为辅助评价指标，通过单因素和多因素统计学分析研究发酵时间、装液量、接菌量和初始pH对纳豆激酶活力的影响，优化发酵条件，以期提升纳豆激酶的表达量。最终确定最优发酵工艺为：摇瓶豆乳的发酵时间30 h，装液量5%，接菌量1.75%，初始pH 5.5。在该发酵条件下，纳豆激酶的活力为429 869.34 IU/mL，是优化前的5.41倍。可见，正交试验成功优化了纳豆枯草芽孢杆菌的液体发酵工艺，显著提升了纳豆激酶的表达量，为功能食品开发奠定了理论基础。
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