本期目录
生物技术进展
2020年 第10卷 第6期
发布日期：2020-11-25
生物计量标准与分析测试专刊
刊首语
生物计量与标准物质:分析结果有效一致的保障
李亮
2020 Vol. 10 (6):
0.
DOI:10.19586/j.2095-2341.2020.0154
摘要 (
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2006年，联合国工业发展组织（United Nations Industrial Development Organization, UNIDO）和国际标准化组织（International Organization for
计量与标准
流式核酸单分子计数方法研究进展
王迪,吴枭,王志栋,高运华
2020 Vol. 10 (6):
573-578.
DOI:10.19586/j.2095-2341.2020.0101
摘要 (
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研发精确灵敏的核酸定量技术，提升对微量样本的测量能力，在当前抗击新冠疫情的背景下尤其重要。流式核酸单分子计数是一种基于“计数”技术的定量测量方法，该方法无需聚合酶链式反应而对荧光标记的靶分子直接定量，测量结果直接溯源到国际基本单位。作为潜在的基准计量方法，它是当前核酸定量测量技术的重要补充，可广泛应用于临床诊断、转基因标识、食品药品残留检测等多个领域。对流式核酸单分子计数方法的原理、检测体系的硬件组成以及数据分析模型进行了综述，并展望了该方法对构建生物计量标准体系的重要意义。
数字PCR技术在核酸标准物质研制中的应用
郑子繁,柳方方,刘卫晓,金芜军,李亮
2020 Vol. 10 (6):
579-584.
DOI:10.19586/j.2095-2341.2020.0128
摘要 (
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在标准物质研制领域，生物标准物质的研制逐渐成为了研究热点，同时基于核酸的检测技术的开发与应用又推动了核酸标准物质的进程。核酸标准物质需要高级别、精准的定值方法，数字PCR作为单分子定量技术得到了广泛的应用。数字PCR是一种测定核酸分子的绝对定量方法，如微滴式数字PCR是采用油包水形成的微滴作为反应室，将含有DNA模板的反应溶液分配到大量独立的反应室中进行扩增反应，再通过统计反应室中的阳性信号来定量DNA的拷贝数，从而达到精确定量核酸拷贝数的目的。综述了近年来关于数字PCR及其在核酸标准物质研究领域的最新应用进展，重点综述了其在转基因检测、医疗诊断等领域的应用进展，以期为核酸标准物质的研制提供参考。
数字PCR仪校准方法研究
王尚君,董莲华
2020 Vol. 10 (6):
585-589.
DOI:10.19586/j.2095-2341.2020.0106
摘要 (
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数字PCR仪是核酸绝对定量的重要仪器，因此确保数字PCR仪检测结果的准确性十分重要。通过对国内市场上数字PCR仪的比较分析，剖析了数字PCR仪的性能指标，对数字PCR仪的校准方法进行了探讨，设定了拷贝数浓度相对示值误差、拷贝数浓度重复性、荧光通道一致性和反应单元个数重复性作为数字PCR仪整机校准的计量技术指标，采用具有溯源性的国家有证标准物质，对方法进行了试验验证。验证结果表明了校准思路和方法的可行性，该方法操作性强，能够满足仪器技术要求以及用户需求, 提高了数字PCR仪检测结果的准确性和可靠性,对进一步拓展和深化数字PCR 技术的应用具有积极的促进作用。
HPV核酸检测标准物质研究进展
杨佳怡,陈桂芳,高运华,王志栋,吴枭
2020 Vol. 10 (6):
590-596.
DOI:10.19586/j.2095-2341.2020.0098
摘要 (
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2018年全球癌症统计数据显示，我国宫颈癌发病率已高居世界第二位，且有发病年轻化的趋势，严重威胁着女性的身体健康。已有研究表明：高危型人类乳头瘤病毒(human papillomavirus，HPV)的感染与宫颈癌的发生密切相关。针对HPV的检测对于宫颈癌的预防和诊断具有重要的意义，目前常见的检测方法是基于PCR技术，对HPV的核酸进行定性和定量分析。然而在缺乏统一标准的情况下，难以保证测量结果准确可比。标准物质作为计量校准的有力工具，可以应用于测量过程的质量控制。讨论了针对HPV的常见检测方法与检测过程中的影响因素，分析了不同形式核酸标准物质和参考品的特点，以期为HPV核酸检测标准物质的研制和使用提供参考，以用于宫颈癌的科学诊断。
蛋白质含量计量技术研究进展
王仙霞,,武利庆,杨彬,张宁,苏萍,杨屹
2020 Vol. 10 (6):
597-606.
DOI:10.19586/j.2095-2341.2020.0139
摘要 (
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21世纪是生命科学的世纪，生命科学的进步和生物产业的发展对测量结果准确可比的需求催生了蛋白质计量技术的产生与发展。经过近20年的发展，蛋白质含量计量技术已经取得突破性进展，并且获得了长足的发展。综述了迄今蛋白质含量计量技术的研究进展及取得的突破，介绍了质量平衡、同位素稀释质谱、定量核磁、电喷雾-差分电迁移-颗粒计数、高效液相色谱-圆二色光谱在蛋白质含量计量中的应用。最后展望了蛋白质含量计量技术未来的发展方向。
六种作物内标准基因开发与检测研究进展
高佳奇,陈硕,王迪,龙艳,李亮,张晓
2020 Vol. 10 (6):
613-622.
DOI:10.19586/j.2095-2341.2020.0127
摘要 (
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内标准基因（internal reference gene）是指能够区分物种的特异性、具有单一或恒定的低拷贝数、低变异的保守DNA序列。指定作物种类的内标准基因在转基因成分检测、物种及其产品判别等众多领域内作为鉴别其他物种的主要遗传标志，尤其是在转基因产品定量定性检测中，可用于检测样品中的物种来源以及转基因含量，对转基因产品定量定性检测具有重要意义。目前，已有多种作物的内标准基因被开发，其中玉米、油菜和水稻开发的内标准基因数量较多，但仍缺乏更为透彻的比较研究，导致选择与应用较为困难。基于此，根据国内外已有的研究成果，综述了6种检测或鉴定需求较大的作物（包括玉米、大豆、油菜、棉花、水稻和小麦）的内标准基因的研究进展，并对常见作物的内标准基因进行了系统的比较和研究，以期为植物源性、转基因成分及相关检测鉴定提供技术支撑。
质量平衡法及其在标准物质定值中的应用进展
郑子繁,刘卫晓,金芜军,李亮
2020 Vol. 10 (6):
623-629.
DOI:10.19586/j.2095-2341.2020.0113
摘要 (
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为保证不同地区、不同时间测量结果的可比性，测量结果需溯源至适当的、规定的参考标准。对于化学、生物、工程、物理学领域的材料和样品测量，该参考标准为标准物质。由此可见，标准物质的定值对物质的检测及定量是十分重要的。标准物质（reference material，RM）是一种足够均匀的、具有一种或多种相对容易确定的特性值的材料或物质，可用于给材料赋值、评价测量方法及校准测量仪器等。质量平衡法作为标准物质的定量方法之一，是一种常用的纯度测量方法，将水分、灰分、挥发组分、无机元素等杂质的含量从100%中扣除，再根据主要组分在有机组分中的百分比来确定物质纯度。质量平衡法具有较高准确度，能够溯源到国际单位制中的质量单位，且若使用基准方法测量样品中的主成分及各部分杂质以完成整个质量平衡法的测量，质量平衡法则有望成为新的基准方法。基于此，对质量平衡法原理及质量平衡法在标准物质的研制中的应用进行了介绍，并对近期质量平衡法在标准物质中的最新应用进行了总结，以期探索质量平衡法在标准物质研制中的更多可能。
人D6S1043-1型STR质粒DNA标准物质的研制
严安心,陈静,刘洪迪,李永久,彭柱,赵禾苗,李亮,赵兴春
2020 Vol. 10 (6):
630-636.
DOI:10.19586/j.2095-2341.2020.0146
摘要 (
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短串联重复序列（short tandem repeat，STR）是存在于人类基因组中的一类具有长度多态性的DNA序列，由含2~6个碱基对的重复单位串联构成。DNA STR分型检验是当前法庭科学进行个体识别和亲缘鉴定的主要依据。STR分型标准物质是DNA STR检验量值溯源的基础和关键物质，对其进行研究将极大推动我国法庭科学DNA STR检验的标准化进程。以STR基因座D6S1043为例，介绍人类基因组中STR序列的质粒DNA标准物质的制备过程。首先，合成包含13个重复单元（\[ATCT\]13）的D6S1043序列（定义为D6S1043-1）并将其与pUC57载体连接构建重组质粒，制备质粒溶液。其次，通过酶切鉴定、Sanger测序、多种STR分型试剂盒的分型鉴定等方法检验DNA序列的准确性。再次，采用微滴式数字PCR方法（droplet digital PCR，ddPCR）检测质粒浓度，评估质粒溶液的均匀性和稳定性。最后，由8家实验室协作，测定浓度标准值，综合分析均匀性检验、稳定性检验、定值过程等引入的不确定度，得到总不确定度；由6家实验室协作，测定D6S1043-1的分型值。结果表明：该标准物质的均匀性、稳定性良好，在-20 ℃可保存6个月，在4 ℃可保存14 d；核酸拷贝数为（7.7±1.2）×103 copies·μL-1；在D6S1043基因座上的分型值为13。人D6S1043-1型STR质粒DNA标准物质 \[编号：GBW（E）091072\] 是我国法庭科学DNA检验领域首批有证标准物质之一，其研制过程为其他STR基因座的质粒DNA标准物质的研制提供了一定的借鉴。
新技术与新方法
基于焦磷酸测序分析技术的金银花掺伪鉴别方法研究
徐石勇,赵新,张富丽,刘征辉,史清洪,宋君,王永,兰青阔
2020 Vol. 10 (6):
637-645.
DOI:10.19586/j.2095-2341.2020.0114
摘要 (
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金银花是大宗药材，市场掺伪时有发生，但目前的检测方法不能满足快速准确的检测需求，因此亟需建立快精准的检测方法。为了确立高精准度和大通量的金银花掺伪鉴别检测方法，结合SNP标记及焦磷酸测序分型分析技术，对金银花及其常见伪品差异性SNP位点进行PCR扩增及焦磷酸测序分析。结果发现，运用焦磷酸测序技术对金银花和山银花的差异性SNP位点进行定量分析，能够对金银花真伪及掺伪量进行鉴定。该方法兼有PCR技术的灵敏性和焦磷酸测序技术的准确性，具有重复性好、自动化程度较高、易操作的特点，能在3小时之内完成金银花成分掺伪量的检测工作，并得出量化结果。
纳米材料在农作物领域的应用及展望
薛琴琴,,韩贝贝,吴雪晴,李沛,李莹莹,,吴庆钰
2020 Vol. 10 (6):
655-660.
DOI:10.19586/j.2095-2341.2020.0118
摘要 (
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近年来，纳米材料成为农业领域的一个研究热点，受到了国内外学者的广泛关注。纳米材料基于其尺寸小的特点，可以在穿透植物细胞壁后，通过内吞作用被细胞吸收，进而对植物生长产生影响。纳米材料被广泛应用于植物遗传转化、作物生长发育和植物健康等农作物领域，尤其在遗传转化领域，其可作为转化载体与基因编辑技术综合运用，对作物进行遗传改良。基于此，对纳米材料在植物体内的吸收、转运机制及其在农作物领域的应用进展进行了综述，重点探讨了纳米材料在植物遗传转化方面的研究进展，并对其在农作物领域亟待解决的问题和后续发展方向进行了展望，以期为拓宽纳米材料的应用领域提供参考。
基于焦磷酸测序技术建立基因编辑水稻检测方法
解美霞,,王燕,赵新,高越,刘双,陈锐,兰青阔,徐晓辉4,曹际娟5,王永
2020 Vol. 10 (6):
668-673.
DOI:10.19586/j.2095-2341.2020.0123
摘要 (
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基因编辑技术发展迅速，但对应的检测方法较少。为寻找创建基因编辑作物适用的检测方法，以 PL3 基因编辑水稻编辑位点为靶标，有效设计了焦磷酸测序的扩增引物及测序引物，并进行有效性检测，分别利用Sequence to Analyze等程序以及SNP和AQ两种模式完成了对PL3 基因的定性和定量检测试验，建立了 PL3 基因编辑水稻编辑位点焦磷酸测序检测方法。结果表明，基于焦磷酸测序技术可以通过检测编辑位点从而将基因编辑型水稻与野生型水稻进行区分。与常规的转基因检测方法相比，该检测方法具有较好的准确性、高效性及高灵敏度等优点，在基因编辑型水稻编辑位点定性和定量检测分析方面具有很好的应用前景。
检测与应用
数字PCR在新型冠状病毒检测中的应用前景
胡思宏,游国叶
2020 Vol. 10 (6):
674-679.
DOI:10.19586/j.2095-2341.2020.0070
摘要 (
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2020年,由新型冠状病毒（SARS-CoV-2）导致的新型冠状肺炎（COVID-19）疫情在世界各国大规模爆发，导致全球公共卫生安全受到巨大影响。目前广泛采用的荧光定量PCR（RT-PCR）在检测SARS-CoV-2方面存在可能出现“假阴性”结果、需多次取样、重复检测等缺点，亟需建立一种灵敏度更高、样本用量少、操作简单的检测技术，以快速、准确、高效的筛选出新型冠状肺炎患者。数字PCR为新兴痕量核酸分子技术，具有灵敏度高、耐受性强、可绝对定量等优点，在病毒检测领域中广泛应用。介绍了SARS-CoV-2病原学特征和荧光PCR检测SARS-CoV-2目前存在的主要问题，并对数字PCR在SARS-CoV-2检测中的应用前景进行了具体阐述，以期为后续开发更高效的检测试剂盒、提高检测准确性提供方案。
核酸层析法转基因快速检测体系的建立及应用
任雯,杨海侠,陈立柱,李雨峰,刘亚
2020 Vol. 10 (6):
680-687.
DOI:10.19586/j.2095-2341.2020.0105
摘要 (
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随着我国转基因研究及产业化进程提速，转基因检测的重要性日益凸显，因而快速、高效的分子检测新方法的研发具有重要的生产实践及科研意义。在转基因检测中，常规PCR技术具有检测范围广的特点，但较为费时费力，且对实验条件要求较高；而胶体金蛋白试纸法检测方便、快捷，但可检范围窄。基于此，建立了一套基于核酸层析法快速转基因检测的方法体系。将经液氨研磨后的样品通过一管法提取DNA后直接进行PCR扩增，再将PCR扩增产物滴加到胶体金检测卡上，通过直接观察胶体金卡条显色状况进行结果判别。此方法最终检验出玉米内参基因ZSSⅡB及Zein、大豆内参基因SPS、水稻内参基因Lectin，转基因元件启动子CaMV35S及终止子NOS，以及抗虫基因Cry1Ab/1Ac、抗除草剂基因Bar、Pat、CP4-EPSPS及选择标记基因NPTⅡ、Pmi等外源基因；并成功检出特异性转基因事件Mir604及Bt11。研究获得的核酸层析检测方法具有灵敏度高、省时省力且对检测条件要求低等优点，集PCR法与蛋白试纸检测法二者优势于一身，可广泛应用于转基因产品的精确快速检测，为我国转基因生物安全监管提供了良好的技术支撑。
耐除草剂玉米G1105E-823C定性检测方法
温洪涛,杨洋,丁一佳,苑冉,张秀杰,张瑞英
2020 Vol. 10 (6):
688-695.
DOI:10.19586/j.2095-2341.2020.0138
摘要 (
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转基因耐除草剂玉米G1105E-823C是经过改造的转mG2-aroA基因耐草甘膦玉米新品系，具有更高的草甘膦耐受性，目前已完成生产性试验，具有重要的产业化应用前景。但目前尚无针对G1105E-823C的转化体特异性检测方法的相关报道，这十分不利于对该品系的检测及监管。基于此，以G1105E-823C转化体特异性序列为靶标，建立了转基因耐除草剂玉米G1105E-823C的普通PCR和实时荧光PCR定性检测方法。结果表明，2种方法均能检测出转基因耐除草剂玉米G1105E-823C转化体成分，且具有较高的特异性。普通PCR检测方法检出限达0.1%，实时荧光PCR检测方法检出限达0.05%。研究建立的2种定性检测方法为转基因耐除草剂玉米G1105E-823C的精准检测提供了新的技术手段，可为农业转基因监管提供技术支撑。
转g10-epsps基因耐除草剂大豆ZUTS-33转化体特异性检测方法的建立
缪青梅,赵杨,徐晓丽,徐俊锋,汪小福,陈笑芸
2020 Vol. 10 (6):
696-703.
DOI:10.19586/j.2095-2341.2020.0124
摘要 (
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(3814KB)(
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转g10-epsps基因耐除草剂大豆ZUTS-33是由浙江大学研发的耐除草剂大豆品系，目前已进入生产性试验阶段。到目前为止尚无文献报道对该转基因新品种的检测方法，因此亟需建立精准的定量检测方法为农业转基因生物安全管理提供技术支持。根据耐除草剂大豆ZUTS-33品系外源基因插入位点特异序列设计引物和TaqMan探针，利用优化的实时荧光定量PCR检测方法评价该引物对和探针的特异性、准确度、精确度和重复性，并确定此检测方法的检测极限（limit of detection，LOD）和定量极限（limit of quantity，LOQ）。实验结果显示，研究所建立的转基因大豆ZUTS-33转化体特异性实时荧光定量PCR检测方法具有高度的品系鉴定特异性，准确度、精确度均符合要求，重复性较好，且检测方法的LOD达到20拷贝，LOQ达到40拷贝。研究结果为转g10-epsps基因耐除草剂大豆ZUTS-33的身份识别和检测监测提供了有效的方法。
普通牛及其近缘种特异性序列筛选及环介导等温扩增检测方法
瞿展,贾犇,杨立桃
2020 Vol. 10 (6):
704-710.
DOI:10.19586/j.2095-2341.2020.0069
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近年来，肉制品掺假事件频频发生，亟需建立快速、可靠的肉制品动物源性成分检测方法，保障肉类食品安全。与常规PCR等检测方法相比，环介导等温扩增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）方法具有高特异性、高灵敏度、反应快、易操作等优势。基于此，利用生物信息算法筛选普通牛及其近缘种（牦牛、水牛、美洲野牛）的全基因组序列，以获得种间相似性序列，进而建立并优化可用于检测普通牛及其近缘种成分的特异性LAMP方法。最终优化后的LAMP反应体系为：10 μmol·L-1外引物F3和B3各0.25 μL，10 μmol·L-1内引物FIP和BIP各2 μL，2 mmol·L-1 dNTP 2.5 μL，25 mmol·L-1 MgSO4 4 μL，5 mol·L-1 甜菜碱 3.5 μL，8.0 U·μL-1 Bst DNA 聚合酶 1 μL，10×ThermoPol Buffer 2.5 μL，DNA模板2 μL，加双蒸水至25 μL；LAMP反应条件为：65 ℃恒温扩增1 h，80 ℃ 10 min。在扩增产物中加入SYBR GreenⅠ荧光染料后，检测结果可用肉眼直接观察。优化后的LAMP方法在1 h内能特异性地检测出普通牛、牦牛、水牛及美洲野牛成分，检测灵敏度达到0.020 ng·μL-1，且可特异性地检测出市售肉制品中含有牛肉成分的样品。研究所建立的LAMP方法具有高特异性、高灵敏度、反应快速、操作简便和无需精密仪器等特点，可应用于肉制品中普通牛及其近缘种成分的实际检测，为我国肉类食品安全提供了有力保障。
餐饮及相关食品中病原菌活菌多重实时荧光PCR检测方法的研究与开发
柯振华
2020 Vol. 10 (6):
717-727.
DOI:10.19586/j.2095-2341.2020.0107
摘要 (
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PDF
(9764KB)(
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为了应对餐饮等食品中病原菌快速检测的需求、研究建立病原菌筛查方法，选取痢疾志贺氏菌（Shigella dysenteriae）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus）、阴沟肠杆菌（Enterobacter cloacae）、产气肠杆菌（Enterobacter aerogenes）、沙门氏菌（Salmonella）、蜡样芽胞杆菌（Bacillus cereus）、大肠埃希氏菌O157∶H7（Escherichia coli O157∶H7）、单核细胞增生李斯特氏菌（Listeria monocytogenes）等9种病原菌开展多重实时荧光PCR方法研究工作。为了节约预增菌时间与提升检测效率，研发了适用于多种病原菌预增菌的通用型培养基，采取高温裂解法提取菌液核酸，利用PMA染料灭活死亡细菌DNA，筛选出活菌DNA，采用多重实时荧光PCR技术检测目标菌，该方法可在16 h内完成检测，对于目标病原菌的检测低限可达103 CFU·mL-1。
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