本期目录

生物技术进展

2018年第8卷第3期发布日期：2018-05-25

CRISPR/Cas基因编辑技术专栏

热点：CRISPR/Cas基因编辑技术

CRISPR/Cas基因编辑技术及其在作物育种中的应用
郑红艳,王磊
2018 Vol. 8 (3): 185-190. DOI:10.19586/j.2095-2341.2018.0059
摘要 ( ) PDF (1053KB)( )
CRISPR/Cas基因编辑技术在植物基因功能研究和作物遗传改良方面具有重要应用价值，其主要依赖gRNA引导核酸内切酶在目标基因组位置产生双链断裂（DSBs），DSBs在通过非同源末端连接（NHEJ）或同源重组（HDR）方式进行修复时，会引起靶标位置核苷酸序列的缺失、插入或者替换，从而实现基因编辑。介绍了CRISPR/Cas基因编辑技术的作用机理及发展趋势，并对CRISPR/Cas技术在主要粮食及经济作物育种中的应用进展进行了总结，以期为农作物育种提供有益的参考。

CRISPR/Cas9在肿瘤治疗中的研究进展
吕宝北,赵鹏翔,张鑫,马雪梅,谢飞
2018 Vol. 8 (3): 191-196. DOI:10.19586/j.2095-2341.2017.0141
摘要 ( ) PDF (1069KB)( )
CRISPR/Cas9技术自从出现以来便迅速应用于肿瘤研究。在肿瘤发生的机理研究中，CRISPR/Cas9可用于研究单核苷酸突变、染色体异位等因素在肿瘤发生中的作用机制，同时也可以用于肿瘤细胞中功能缺陷基因的筛选。在肿瘤治疗方法的研究中，CRISPR/Cas9主要用于诱发机制比较清晰且诱因为病毒的肿瘤类型，例如鼻咽癌、宫颈癌等，通过对相应病毒的基因进行编辑从而抑制其致癌作用。利用CRISPR/Cas9技术还可以加速新肿瘤治疗靶点基因的发现。尽管发展和应用十分迅速，但是CRISPR/Cas9在肿瘤研究和治疗中的作用仍然受多种因素的限制，包括Cas9和sgRNA的输送效率、脱靶效应以及安全性和成本等。对CRISPR/Cas9在肿瘤研究中的应用进展进行了综述，以期为肿瘤发生、转移机制和肿瘤治疗等方面的研究提供参考。

进展评述

牛肌肉生长抑制素基因突变的遗传效应与育种应用
魏著英,白春玲,李光鹏
2018 Vol. 8 (3): 197-205. DOI:10.19586/j.2095-2341.2018.0064
摘要 ( ) PDF (4891KB)( )
肌肉生长抑制素（myostatin，MSTN）基因主要在骨骼肌中表达，参与调控骨骼肌的生长发育。MSTN基因在不同物种中具有极强的进化保守性，同时还具有较多的突变多态性。在牛的不同品种中，存在不同位点的有义突变，突变型牛均表现为骨骼肌发达，呈现双肌表型，生长速度与产肉率显著提高。同时，该基因突变也引起显著的生理性遗传效应。对国内外肉牛的MSTN基因突变类型、突变后遗传效应及在肉牛育种应用等方面作了重点阐述，以期为我国地方品种肉牛改良和选育研究提供参考。

蛋白质组学技术在肉类鉴别及肉质分析中的应用进展
胡争艳,王军淋,吴平谷,王天娇,王立媛,汤鋆
2018 Vol. 8 (3): 206-213. DOI:10.19586/j.2095-2341.2018.0022
摘要 ( ) PDF (1098KB)( )
肉制品是人体中蛋白质和多种微量元素的重要来源，但对于肉制品中肉类的鉴别及品质分析的研究受到了传统方法的限制。近年来，蛋白质组学技术的应用极大地推动了肉类鉴别技术的发展，并对肉质形成的潜在分子机制的研究有着深远的影响。主要介绍了蛋白质组学的概念及其研究策略，全面综述了蛋白质组学技术在肉类鉴别和肉质分析中的应用进展，并展望了其研究前景，以期为肉制品的质量控制及肉质影响因素的研究提供理论依据。

热激转录因子在植物抗非生物胁迫中的功能研究进展
李丽,刘双清,杨远航,戴良英,李魏
2018 Vol. 8 (3): 214-220. DOI:10.19586/j.2095-2341.2018.0002
摘要 ( ) PDF (1221KB)( )
植物在遭受环境胁迫时会产生一系列应激反应，而热激转录因子可通过介导热激蛋白或其他热诱导基因的转录和表达，来参与调控植物抵抗逆境胁迫过程和其他生命活动。主要介绍了植物热激转录因子的基本蛋白结构域，阐述了3类热激转录因子在抗极端温度（高温、低温）胁迫、干旱胁迫、高盐胁迫、活性氧胁迫中的功能与作用机制，并探讨和展望了植物热激转录因子在植物育种和提高植物抗逆性的研究中的发展与应用前景，以期为深入研究热激转录因子在调控植物抵抗逆境胁迫中的生物学功能与机制提供理论参考。

小麦低分子量麦谷蛋白亚基功能标记研究进展
高振贤,曹巧,何明琦,田国英,王飞,单子龙,韩然
2018 Vol. 8 (3): 221-228. DOI:10.19586/j.2095-2341.2018.0024
摘要 ( ) PDF (1123KB)( )
小麦是我国主要的粮食作物之一，籽粒中的低分子量麦谷蛋白对于小麦面包的加工品质具有重要的作用。近年来，利用分子标记技术检测小麦低分子量麦谷蛋白亚基（low molecular weight glutenin subunit，LMW-GS）的类型和组成已成为小麦品质改良的研究热点之一。主要综述了小麦低分子量麦谷蛋白亚基基因和蛋白质的结构特征、分类以及功能标记的研究进展，讨论了开发利用小麦Glu-A3、Glu-B3、Glu-D3位点LMW-GS功能标记的意义及存在的问题，并强调了LMW-GS分子标记检测技术的革新及亚基类型的完善对小麦品质改良的重要性，以期加速LMW-GS功能标记在优质小麦育种工作中的应用进程。

BAG-1蛋白及其对神经系统疾病调控研究进展
张亚婷,靳小艳,钟国徽,厉建伟,李英贤,马雪梅
2018 Vol. 8 (3): 229-236. DOI:10.19586/j.2095-2341.2017.0159
摘要 ( ) PDF (3166KB)( )
B细胞CLL/淋巴瘤2关联凋亡基因1（B-cell CLL/lymphoma 2-associated athanogene-1，BAG-1）编码的蛋白是一种多功能结合蛋白，包含不同功能的结构域，可与抗凋亡蛋白（Bcl-2）、热激蛋白70（heat shock protein 70，Hsp70/Hsc70）、细胞转化分裂介质（Raf-1）、类固醇激素受体和DNA等结合，对于调节细胞凋亡、信号传导、基因转录、细胞增殖与分化等具有重要作用。BAG-1参与多种神经系统疾病（如阿尔茨海默病、帕金森氏病、亨廷顿舞蹈病、脑中风、脊髓损伤以及神经精神障碍疾病）的发生发展过程。主要就BAG-1的结构、功能及其对神经系统疾病影响的研究进展进行了综述，以期为神经系统疾病的研究和治疗提供参考。

研究论文

宏基因组来源果胶酸裂解酶在毕赤酵母中的表达及应用
董俊帅,秦星,张志伟,张宇宏,张伟
2018 Vol. 8 (3): 237-245. DOI:10.19586/j.2095-2341.2018.0041
摘要 ( ) PDF (4725KB)( )
果胶酸裂解酶可用于含果胶废水的处理、纸浆漂白以及棉麻纺织品的生物精炼等。基于高通量宏基因组测序技术，从富含果胶土壤宏基因组中挖掘得到一个果胶酸裂解酶基因pela。将pela连接表达载体pPIC9转化毕赤酵母Pichia pastoris GS115。在3 L发酵罐水平，甲醇诱导10 h后，培养基中果胶酸裂解酶活力达到10.8 U/mL。重组PELA的最适温度为45℃，最适pH为9.0，在pH 7.5~11.0具有良好的稳定性。PELA的比活力为244.12 U/mg，以聚半乳糖醛酸为底物时催化反应的Km和Vmax分别为0.26 mg/mL和488.40 μmol/min·mg。EDTA及金属离子Cd2+、Zn2+、Mn2+、Cu2+、Fe3+能够高度抑制酶的活性，1 mmol/L Ca2+和2 mmol/L K+对酶活力有促进作用。将重组PELA作用于苎麻纤维4 h后，纤维质量损失率达到9.2%，苎麻纤维分散度和白度都明显提高。结果表明从宏基因组来源的果胶酸裂解酶PELA在苎麻脱胶中具有良好的应用潜力。

hTNFR1在大肠杆菌中可溶性表达及纯化
韩平,盖园明,朱蓓薇,张大伟
2018 Vol. 8 (3): 246-253. DOI:10.19586/j.2095-2341.2018.0021
摘要 ( ) PDF (7242KB)( )
将人源肿瘤坏死因子Ⅰ型受体（hTNFR1）基因克隆到pET-22b表达载体,成功构建了重组表达质粒pETH1，电转到Escherichia coli BL21（DE3）表达菌株中进行摇瓶发酵。实现了hTNFR1在大肠杆菌表达系统中的重组表达。但目的蛋白全部以包涵体的形式存在于沉淀中。为了提高hTNFR1在大肠杆菌中的可溶性表达，融合标签和分子伴侣两种策略被实施用于辅助hTNFR1的可溶性表达。结果表明，在hTNFR1的N端融合NusA标签后，hTNFR1的可溶性有一定提高；在NusA-hTNFR1基础上，过表达了7种分子伴侣，筛选出tig分子伴侣对hTNFR1蛋白可溶性表达有明显的促进作用，可溶性表达量约占总量的90％；对优化后的hTNFR1表达系统的可溶性蛋白进行Ni-NTA亲和层析纯化后，TEV蛋白酶酶切去除N端的NusA标签，结合Western blot分析鉴定，获得了大量高纯度的hTNFR1蛋白。研究结果为进一步研究hTNFR1的生理学活性及其在疾病治疗方面的应用奠定了良好基础。

单增李斯特菌prsA1基因的截短表达、纯化及多克隆抗体的制备
孙静娟,邱景璇,曾海娟,丁承超,王广彬,李杰,王淑娟,刘箐
2018 Vol. 8 (3): 254-260. DOI:10.19586/j.2095-2341.2017.0163
摘要 ( ) PDF (4366KB)( )
单增李斯特菌（Listeria monocytogenes）是一种常见的食源性致病菌，能够引发李斯特菌病，对食品安全构成巨大威胁。prsA1具有保守性和特异性，利用SignalP 4.1 Server程序、TMHMM Server V.2.0程序和SEPPA 2.0程序预测了PrsA1的信号肽段、跨膜区域及空间抗原表位，预测结果显示PrsA1的N端含有信号肽段及跨膜区且该蛋白具有良好抗原表位结构，因而可作为检测靶标。在此基础上，采用PCR法获得prsA1的非跨膜区序列即Δ84prsA1，构建重组质粒pET30a-Δ84prsA1并转入到大肠杆菌中诱导表达Δ28PrsA1，Ni-IDA柱亲和纯化重组蛋白Δ28PrsA1，以纯化的Δ28PrsA1为抗原制备多克隆抗体。间接ELISA检测多克隆抗体的效价，高达1∶128 000。Western blotting分析结果显示该多克隆抗体能够识别从单增李斯特菌中提取的PrsA1蛋白。利用生物信息学筛选检测靶标并分析抗原表位结构，最后成功制备了多克隆抗体，为单增李斯特菌检测靶标的筛选和免疫学检测提供了实践基础。

茧蜂病毒感染Hi5细胞与亲环素A的相关性研究
胡艳,许翠仙,张潘,俞丹,张斌月,李明
2018 Vol. 8 (3): 261-268. DOI:10.19586/j.2095-2341.2017.0143
摘要 ( ) PDF (2707KB)( )
茧蜂病毒（Microplitis bicoloratus bracovirus，MbBV）属于多分DNA病毒（polydnavirus，PDV）的一种，主要存在于膜翅目茧蜂科寄生蜂中，对于寄生蜂成功寄生宿主起着至关重要的作用。而亲环素A（cyclophilin A，CypA）是一种肽基脯氨酰顺反异构酶，参与免疫反应等多种细胞活动。主要探讨了茧蜂病毒在感染昆虫细胞的过程中，是否与CypA存在相关性。研究结果显示，在粉纹夜蛾(Trichoplusia ni Hübner)卵细胞系（High Five，Hi5）培养基中加入茧蜂病毒24 h后，通过PCR可扩增出与病毒基因大小一致的目的片段，表明Hi5细胞已被茧蜂病毒感染。在病毒感染细胞后，CypA的基因转录水平显著升高，其蛋白表达水平也有所增加；当沉默cypa基因或抑制CypA活性后，实时荧光定量PCR（real-time fluorescence quantitative PCR，qRT-PCR）结果显示，茧蜂病毒基因中的vank86基因转录水平显著下降；而过表达cypa基因，可使vank86基因转录水平上升。研究结果提示，茧蜂病毒在感染昆虫细胞的过程中，可能与CypA存在一定的相关性。

敲除LSD1基因对人慢性髓系白血病K562细胞周期的影响
任思蕊,王冰蕊,郭青,冯甜甜,王鼎,高洁,石莉红
2018 Vol. 8 (3): 269-273. DOI:10.19586/j.2095-2341.2018.0031
摘要 ( ) PDF (1519KB)( )
为了探讨敲除LSD1基因后抑制人慢性髓系白血病 K562细胞增殖的原因，使用前期CRISPR/Cas9技术构建的人慢性髓系白血病 K562 LSD1基因敲除株，通过细胞凋亡Annexin V/PI（碘化丙啶）双染色、细胞PI染色以及流式细胞术技术，探究敲除LSD1基因后，K562细胞的凋亡水平是否改变，细胞周期是否受到影响。结果表明敲除LSD1基因后K562细胞被阻滞在G0/G1期，进入DNA复制期的细胞变少，因此导致细胞增殖速度减慢；通过细胞凋亡Annexin V/PI双染色并分析早期以及晚期凋亡细胞总比例，显示敲除LSD1基因后，不影响K562细胞的凋亡。研究结果表明，敲除LSD1基因后人慢性髓系白血病 K562细胞的增殖受到抑制，这是由于K562细胞增殖周期发生了改变，进入DNA复制期和分裂期的细胞减少；而与细胞凋亡水平的变化无关。