本期目录
生物技术进展
2021年 第11卷 第3期
发布日期：2021-05-25
进展评述
数字PCR在食源性致病菌检测中的应用进展
卢海强,焦新雅,,吴思源,王娅丽,刘璐,程书梅,张晓,苏晓峰
2021 Vol. 11 (3):
260-268.
DOI:10.19586/j.2095-2341.2021.0001
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食源性致病菌是食品安全的重大隐患，对人类健康造成极大危害，因此亟待研究和建立精准有效的食源性致病菌检测方法。随着单分子检测技术的快速发展，数字PCR技术因其具有超高的灵敏度、稳定性和低试剂消耗等优点而被广泛应用于食源性致病菌的检测。主要介绍了数字PCR的基本原理及其研究进展，深入探讨了其在检测大肠杆菌（Escherichia coli）、沙门氏菌（Salmonella）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、空肠弯曲菌（Campylobacter jejuni）、志贺氏菌（Shigella）、克罗诺杆菌（Cronobacter）、副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus）、单核细胞增生李斯特氏菌（Listeria monocytogenes）和蜡状芽孢杆菌（Bacillus cereus）中的应用，为今后该技术在食源性致病菌检测中的研究与应用提供一定的技术性参考。
植物精油对铜绿假单胞菌群体感应系统的抑制作用研究进展
曾桃花,,李文茹,谢小保,施庆珊,张建设
2021 Vol. 11 (3):
279-288.
DOI:10.19586/j.2095-2341.2020.0165
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群体感应（quorum sensing，QS）是细菌个体与个体之间的一种交流机制，广泛存在于细菌中。铜绿假单胞菌是人类的一种条件致病菌，它具有至少3种QS系统，即las、rhl和pqs系统，且各系统之间存在着级联调控关系，它们共同作用调控着该菌众多毒力基因的表达和毒力因子的产生。近年来，通过抑制铜绿假单胞菌的QS系统以控制其毒力和致病力，成为一种新型的铜绿假单胞菌感染防控策略。植物精油是一种天然的群体感应抑制剂（quorum sensing inhibitors, QSI），多种精油活性化合物都能抑制铜绿假单胞菌的QS系统，而且尚未发现细菌对其产生耐药性。基于此，梳理了铜绿假单胞菌QS系统的组成及其级联调控关系，简要介绍了植物精油的QS抑制机制和抑制活性，并重点综述了萜烯类化合物、芳香族化合物、脂肪族化合物、含硫含氮化合物4类精油化合物对铜绿假单胞菌QS系统抑制作用的研究进展，以期为从天然化合物中发现和筛选安全、高效的细菌QSI的相关研究提供参考，并为致病菌的防控奠定理论基础。
植物内质网胁迫研究进展
张融雪,孙玥,苏京平,王胜军,刘燕清,佟卉,孙林静
2021 Vol. 11 (3):
289-297.
DOI:10.19586/j.2095-2341.2020.0147
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内质网是蛋白质折叠和蛋白质糖基化修饰的重要场所。在内质网中存在多种调控机制来确保其中的蛋白质被正确地折叠、修饰和组装，以维持内质网稳态，这对于细胞正常的生理活动十分重要。然而，多种物理、化学因素均可使内质网稳态失衡，即在应激条件下，错误折叠和未折叠蛋白质的大量积累将导致内质网胁迫(endoplasmic reticulum stress, ERS)，进而会引起未折叠蛋白质响应(unfolded protein response, UPR)，极端情况下还会启动细胞程序性死亡(program cell death, PCD)。目前，植物内质网胁迫方面的研究较酵母和动物滞后，因此，从内质网质量控制系统和未折叠蛋白质响应2个方面对植物内质网胁迫现有研究进行了综述，以期为进一步理解内质网胁迫与植物逆境胁迫的关系提供参考。
植物褪黑素研究进展
张融雪,孙玥,苏京平,王胜军,佟卉,刘燕清,孙林静
2021 Vol. 11 (3):
297-303.
DOI:10.19586/j.2095-2341.2020.0148
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褪黑素最初是在动物中发现的一种吲哚类小分子，具有昼夜节律调节、清除自由基等多种生理功能，还具有改善睡眠的保健作用。后来在植物中也检测到了褪黑素，这表明植物也能合成褪黑素。随着对植物褪黑素的深入研究，发现褪黑素在调控植物生长发育、耐受干旱、高温、低温、高盐、重金属等非生物胁迫、抵御细菌和真菌病害方面具有重要作用。从植物褪黑素合成途径、生长发育调控和胁迫应答反应方面的研究进展进行了综述，以期为植物褪黑素研究提供参考。
蛋白多肽类药物长效化技术研究策略
庞丽然,贺丞,魏敬双,高健
2021 Vol. 11 (3):
304-310.
DOI:10.19586/j.2095-2341.2020.0160
摘要 (
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多肽/蛋白质类药物普遍存在体内半衰期短的问题，使其应用受到了限制。近年来，蛋白质半衰期的研究取得了很大的进展，许多技术已经被提出并测试延长治疗性蛋白的作用时间，如与其他蛋白基因融合(免疫球蛋白域或血清蛋白，如白蛋白)、与聚合物结合(PEG化修饰、聚唾液酸化、HEP化等)。这些技术主要基于本身较长的半衰期及循环机制调控以延长多肽/蛋白质类药物的半衰期。针对上述的多种长效化方式及相关产品进行了综述与讨论，以期为此类药物的长效化研究提供思路。
抗糖尿病药物治疗阿尔茨海默病的研究进展
廖敏,杨洛,王珍,郝亚荣
2021 Vol. 11 (3):
311-315.
DOI:10.19586/j.2095-2341.2021.0010
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阿尔茨海默病（Alzheimers disease, AD）是以认知缺陷为主要特征的慢性疾病，目前尚无有效根治药物。由于患者数量显著增长，探究治疗AD的药物成为国内外的研究热点。近年流行病学研究表明，2型糖尿病是AD的危险因素，两者具有共同的病理生理机制，如胰岛素抵抗、淀粉样蛋白沉积、Tau蛋白过度磷酸化、炎症反应和氧化应激等。因此，从现有的抗糖尿病药物中筛选AD的治疗药物是目前研究的一种趋势。越来越多的研究已证实降糖药物（如胰岛素、二甲双胍等）具有改善AD病变的有益作用。从AD与2型糖尿病的相关性、抗糖尿病药物治疗AD两个方面综述了抗糖尿病药物治疗AD的研究进展，以期为AD的治疗拓宽思路。
mTOR信号通路在糖尿病肾病发病机制中的研究进展
王珍,杨洛,廖敏,郝亚荣
2021 Vol. 11 (3):
316-321.
DOI:10.19586/j.2095-2341.2020.0157
摘要 (
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糖尿病肾病（diabetic nephropathy，DN）是糖尿病最常见的并发症之一，因其具有高发病率且与晚期肾病、心血管疾病和过早死亡等风险相关，糖尿病肾病已成为全球性的公共健康问题，但目前其发病机制尚不清楚。雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）是一种丝氨酸/苏氨酸的蛋白酶，在延迟细胞凋亡以及促进细胞分裂、细胞存活、血管生成中发挥着重要作用。近年来有研究表明，mTOR存在于DN进展的关键步骤中，包括自噬、炎症及氧化应激等。因此，就mTOR介导的自噬、炎症及氧化应激信号通路在DN发病机制中的相关研究进展做一综述，以期为DN治疗及预防提供理论参考。
研究论文
玉米灵芝菌粮营养成分及加工特性变化研究
雷彤彤,王丽花,吴元元,陈妍菲,唐选明
2021 Vol. 11 (3):
322-329.
DOI:10.19586/j.2095-2341.2020.0150
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玉米作为主要的杂粮谷物，营养价值高，维生素、膳食纤维等含量丰富，可以预防多种亚健康疾病，受到市场追捧。但是玉米粉营养结构不均衡、加工性差，限制其应用。有研究表明，微生物发酵技术可以改善谷物的营养成分、大分子物质结构和加工特性。基于此，利用灵芝固态发酵玉米，得到玉米灵芝菌粮（简称菌粮），从营养成分、大分子物质结构和加工特性3个方面对其进行评价。结果显示，与未发酵玉米相比，菌粮中碳水化合物、蛋白质含量分别提高了748%、28.00%，且蛋白质的氨基酸评分提高，而脂肪含量降低了52.56%；维生素C、核黄素和烟酸含量均显著提高（P<0.05），分别提高了56.19%、73.91%和20.27%，且玉米中缺乏的硫胺素在菌粮中被检测到；菌粮中各类淀粉和纤维的含量也发生了显著变化（P<0.05），淀粉、支链淀粉含量分别降低了11.17%、34.70%，直链淀粉含量提高了26.66%，粗纤维、不溶性膳食纤维含量分别降低了21.07%、21.47%，可溶性膳食纤维含量提高了13.57%；菌粮粉粘度降低，水溶性指数提高，吸水性指数和溶胀力降低；此外，与灵芝子实体相比，菌粮中灵芝三萜和灵芝酸含量均显著提高（P<0.05），分别为灵芝子实体的1.68和2.07倍。灵芝固态发酵玉米得到的玉米灵芝菌粮，营养结构更加均衡，功能活性提高，具有更高的营养价值；大分子物质结构发生改变，加工特性得到改善，冲调特性更好。研究结果为食用菌发酵改良谷物特性的研究提供了参考和指导。
张掖市不同海拔地区5个胡麻品种品质特性比较分析
缪纯庆,刘秦,范惠玲,王娟,白生文,何淑萍,白静,吴子孝
2021 Vol. 11 (3):
330-337.
DOI:10.19586/j.2095-2341.2020.0131
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胡麻是甘肃省主要经济作物之一，海拔2 400 m以下的河西地区为甘肃高产区。为探明张掖不同海拔高度对胡麻品质特性的影响和不同胡麻品种的最佳种植区域，利用近红外品质分析仪，分析了张掖市4个不同海拔地区5个胡麻品种的常规品质指标、饱和脂肪酸和不饱和脂肪酸的含量差异。结果表明：蛋白质、粗脂肪、膳食纤维、棕榈酸、十七碳酸、豆蔻酸、二十四碳酸、油酸和α-亚麻酸含量的品种和海拔间互作效应极显著(P<0.01)；山嵛酸、棕榈油酸、顺-11-二十碳一烯酸、亚油酸、γ-亚麻酸和顺-11,14,17-二十碳三烯酸含量随海拔高度不同，变化较小，稳定性好。在高含油量育种目标的基础上，兼顾高三大主要不饱和脂肪酸（α-亚麻酸、油酸和亚油酸）、低两大饱和脂肪酸（棕榈酸和硬脂酸）以及高蛋白质等其他品质育种目标的角度考虑，在张掖市甘州区、高台县巷道镇和民乐县三堡镇、民乐县六坝镇，最适宜种植的胡麻品种分别是5-9812-2-1、09-3-11、张亚2号。不同海拔高度对胡麻各品质指标具有重要影响，张掖市作为优质胡麻籽生产基地，可利用不同胡麻品种适宜种植区域不同，大力发展胡麻籽品质育种和胡麻籽综合开发等。
森林转基因林木抽样策略的研究
赵毅强,蔡新宇,秦朝秋,高秉铮,徐君怡
2021 Vol. 11 (3):
338-343.
DOI:10.19586/j.2095-2341.2020.0159
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转基因技术加快了林木遗传改良的进程。由于转基因林木存在潜在的生态风险，有必要对森林中转基因林木的分布等情况进行监测。基于无人机(unmanned aerial vehicles,UAV)获取的森林平面影像，提出了真实地形下森林转基因林木抽样监测的策略。首先根据检验参数来确定需要抽样的样本数，然后改进了两种算法分别进行不规则区域内常规的和有孔洞情况下的均匀抽样。与之前的抽样方法相比，本方法提供了更好的抽样准确性和均匀性，更适应森林区域的实际情况。
黑鲷ELO基因编码蛋白结构与功能的生物信息学分析
许广平,张志勇,任忠宏,张志伟
2021 Vol. 11 (3):
344-352.
DOI:10.19586/j.2095-2341.2020.0143
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黑鲷是一种抗逆性强的海水经济鱼类，但在长江以北无法在室外自然越冬，每年进行室内越冬又耗时耗力。为了培育黑鲷耐低温品系，探究黑鲷低温耐受的分子机制，研究了黑鲷脂肪酸延长酶（fatty acid elongase，ELO）基因编码蛋白的结构和功能。首先，运用DNAman 8软件对黑鲷、金头鲷、鱖鱼、斜带石斑鱼、鲤鱼等5种鱼类的ELO蛋白进行氨基酸序列比对，分析其同源性和进化关系；随后，利用生物信息学工具对黑鲷ELO蛋白的理化性质、亚细胞定位、信号肽、跨膜区、剪切位点、蛋白磷酸化、糖基化、二级结构、结构域、分子功能及蛋白质相互作用等进行分析，并进行同源建模与三维结构预测。氨基酸序列比对结果显示，黑鲷与其他鱼类之间序列的同源性较高，在所分析的5种鱼类中，黑鲷与金头鲷亲缘关系最近，与鲤科鱼类亲缘关系最远。生物信息学分析结果表明，ELO蛋白为碱性、小分子、稳定、非分泌型亲水蛋白质，亚细胞定位于细胞质、细胞核和线粒体；该蛋白质中存在22个剪切位点、19个磷酸化位点和 9个赖氨酸糖化作用位点，没有糖基化位点和信号肽；其包含多种二级结构，其中以α-螺旋为主，存在1个结构域及7个跨膜区域；ELO蛋白与其他10个蛋白质可能存在直接的相互作用关系，有可能影响雌激素合成。通过对黑鲷ELO基因编码蛋白结构与功能的生物信息学分析，初步判定其与低温耐受相关。研究结果为黑鲷耐低温品系选育提供了基础理论依据。
长期饮用富氢水对正常大鼠生理功能的影响
何晋,寻治铭,谢飞,仪杨,刘梦昱,赵鹏翔
2021 Vol. 11 (3):
353-360.
DOI:10.19586/j.2095-2341.2021.0026
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大量动物实验和临床试验显示，氢气可能对疾病的预防或治疗有积极作用。尽管目前氢气的安全性已被广泛认可，但是长期氢气干预是否会对机体的生理功能产生影响还缺乏实验数据支持。为了探究长期饮用富氢水（hydrogen-rich water, HRW）对生理功能的影响，测试了长期饮用富氢水大鼠的体重、脏器重量、饮水进食及排泄量、心脏功能、血常规和血清生化指标。研究发现：富氢水对血常规/空腹血糖/肝功能无显著影响；富氢水能够显著提高大鼠血清甘油三酯水平（P＜0.05），而胆固醇、胆汁酸和尿酸水平无显著变化；富氢水对大鼠心脏功能无显著影响；富氢水能够显著提高大鼠脑组织重量（P＜0.05）；富氢水对大鼠体重、其他脏器重量、饮食进水量和排泄量无显著影响。对富氢水干预后的长期影响效果的观察具有一定的基础研究价值和临床参考意义。
优化CD115稳定性因素以精确检测小鼠单核细胞及其亚群
刘怡宁,宋濬哲,蒋晓,陈超,周圆,邢文
2021 Vol. 11 (3):
361-368.
DOI:10.19586/j.2095-2341.2021.0028
摘要 (
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单核细胞是机体防御系统的重要组成部分，单核细胞数量发生改变一定程度上可反映机体炎症或其他疾病状态。应用流式细胞术对单核细胞表面抗原进行检测，可了解单核细胞占比变化，有助于揭示单核细胞在疾病发生和转归中的作用。鉴于小鼠单核细胞特异性抗原CD115的稳定性较差，在流式检测过程中，对其影响因素进行优化，以确保检测结果的准确性。首先，探讨CD115抗原-抗体结合前后温度和放置时间对其影响及多聚甲醛（paraformalclehyde，PFA）固定对CD115稳定性的保持作用。在此基础上，通过组合流式抗体CD11c、 CD49b、 Ly6G、 Ter119、 CD3e 和 B220选定阴性细胞群，再用CD11b和CD115圈门得到双阳性的单核细胞，最后根据Ly6C表达强弱区分单细胞亚群。结果显示，温度和放置时间对小鼠单核细胞CD115的稳定性影响显著。将小鼠样本在冰上放置6 h时，CD11b和CD115双阳性细胞比例仍保持稳定,在室温放置1 h即明显下降,在37 ℃放置0.5 h则大部分消失。该结果在抗体结合前后趋势一致。PFA固定后，在4 ℃条件下避光保存， CD11b和CD115双阳性细胞比例可稳定保持3 d。在此优化条件下，应用组合抗体可较好地分析小鼠单核细胞及其亚群，为精准检测小鼠单核细胞提供了技术支持，并为进一步研究单核细胞生物学特性及其在疾病中的作用提供了可能。
IL-13抑制剂在损伤大鼠尾椎间盘退变中的作用研究
陶红平,张觅,游长江,戈惠,刘洋,郑先念
2021 Vol. 11 (3):
369-377.
DOI:10.19586/j.2095-2341.2021.0038
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为了探讨IL-13细胞因子在损伤后大鼠椎间盘退变中的影响，建立了大鼠尾椎间盘退变模型，给予IL-13抑制剂sIL-13Rα2-Fc进行干预，将实验分为空白、对照、低剂量、中剂量、高剂量干预组。分别于4周及6周后通过HE染色和Masson染色观察椎间盘形态变化并评分；DMMB法定量分析椎间盘中的糖胺多糖(glycosaminoglycan,GAG)、硫酸软骨素(chondroitin sulfate,CS)、硫酸角质素(keratan sulfate,KS)、透明质酸(hyaluronic acid,HA)含量变化；RT-PCR分析Ⅰ型和Ⅱ型胶原蛋白的mRNA表达水平；蛋白质印迹分析Ⅰ型和Ⅱ型胶原蛋白含量。HE和Masson染色显示与对照组相比，干预组椎间盘病理改变减小，纤维环排列更规则，破裂部位减小，NP细胞数量增加，胶原纤维减少。sIL-13Rα2-Fc干预增加了糖胺多糖、透明质酸含量，增加了硫酸软骨素/硫酸角质素比,减少了Ⅰ型胶原蛋白的表达,并增加了Ⅱ型胶原蛋白。结果表明IL-13抑制剂sIL-13Rα2-Fc可有效减轻椎间盘退变，并且与作用时间和浓度成正相关。
小鼠腹膜炎模型下血小板的生物学特征及其转录组变化
孙志强,夏美娟,郑琳,赵晶晶,苏培,王洪涛,周家喜,刘翠翠
2021 Vol. 11 (3):
378-385.
DOI:10.19586/j.2095-2341.2021.0021
摘要 (
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作为血液中最小的无核血细胞，血小板除具有经典的止凝血功能外，在调节固有免疫和适应性免疫方面也发挥着重要作用。但是，对于血小板参与免疫调节的分子机制，目前研究相对较少。通过给小鼠腹腔注射热灭活的大肠杆菌构建了急性炎症模型，并借助血常规、流式细胞术等实验方法检测了炎症条件下腹腔免疫细胞以及外周血细胞的动态变化。研究发现，在感染早期小鼠外周血中性粒细胞能快速迁移至腹腔参与炎症反应，同时，血小板的数目和大小在感染早期也会发生显著变化。进一步的RNA-Seq分析发现，小鼠血小板的转录组在感染后发生显著改变，其中，免疫反应相关基因显著上调，血小板表面黏附分子的表达也显著增强。研究结果揭示了急性炎症条件下血小板转录组的变化，为了解血小板免疫功能的潜在分子机制提供了新的角度。
来源于Bacillus sp. AR9 D-海因酶半理性设计的研究
樊帅,刘坤,金媛媛,杨兆勇
2021 Vol. 11 (3):
386-392.
DOI:10.19586/j.2095-2341.2021.0049
摘要 (
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D-对羟基苯甘氨酸是一种重要的精细化工品，在制药行业具有广泛的应用前景。酶法是生产D-对羟基苯甘氨酸的主要手段，但由于缺乏高催化效率的酶而限制了D-对羟基苯甘氨酸的生产。为了提高来自Bacillus sp. AR9的D-海因酶（HYD）的催化效率，进而提高D-对羟基苯甘氨酸的产量，对HYD的底物结合通道进行分析，选取底物通道瓶颈处的氨基酸进行饱和突变和筛选，以提高HYD的催化效率。结果显示，突变体F159S、F159A和F65V的活性相较于野生型HYD分别提高了51%、40%和17%，通过对突变体F65V、F159S和双位点突变F65V/F159S的酶动力学研究发现，突变体的Km值基本与野生型HYD相似，而kcat是野生型HYD的1.3、1.9和2.0倍，最终双位点突变F65V/F159S的催化效率kcat/Km是野生型HYD的2.4倍。高催化效率突变体的获得，以及对突变体动力学的分析，对酶法制备D-对羟基苯甘氨酸具有重要的研究意义和应用价值。
基于双酶偶联法合成尿苷二磷酸葡萄糖醛酸的研究
何丽丽,窦文芳,吕海超,薛欣欣,张文,江南
2021 Vol. 11 (3):
393-402.
DOI:10.19586/j.2095-2341.2021.0007
摘要 (
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尿苷二磷酸（uridine diphosphate，UDP）-葡萄糖醛酸是细胞内重要的糖基供体，参与多种代谢途径，也是体外进行糖基化反应的重要糖基供体，但其价格昂贵、工艺复杂，限制了其大量使用，无法满足生产需求。基于此，利用双酶偶联法氧化UDP-葡萄糖生成UDP-葡萄糖醛酸，并研究反应产物的合成情况。以UDP-葡萄糖为底物、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide，NAD+）为辅因子，利用化脓性链球菌Streptococcus pyogenes源的尿苷二磷酸葡萄糖脱氢酶（UDP-glucose dehydrogenase，UGD）、猪源的乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase，LDH），双酶偶联催化合成UDP-葡萄糖醛酸，并通过高效液相色谱、质谱及核磁共振氢谱对反应产物进行检测，确定产物的结构及产物的生成量。结果表明，利用双酶偶联法氧化UDP-葡萄糖所得到的产物为UDP-葡萄糖醛酸。在UGD的作用下，氧化UDP-葡萄糖生成UDP-葡萄糖醛酸，同时辅因子NAD+在LDH的作用下实现循环再生，减少高能产物辅酶还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（reduced nicotinamide adenine dinucleotide，NADH）对反应的反馈抑制作用，产物的生成率约为60.17%。研究提高了产物UDP-葡萄糖醛酸产物生成量，为后续工业化制备提供了新思路。
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