本期目录
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生物技术进展
2017年 第7卷 第4期
发布日期：2017-07-25
进展评述
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烤烟缓/控释钾肥研究进展
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韩丹,刘金,黎妍妍,涂书新4,黄五星,郝三辉,许自成
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2017 Vol. 7 (4):
261-265.
DOI:10.19586/j.2095-2341.2016.0118
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摘要 (
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发展烤烟缓/控释钾肥对于保护生态环境及降低农业生产成本具有重要的意义。总结了国内外有关缓/控释钾肥在烤烟上的相关研究和应用进展，介绍了缓/控释钾肥的基本概念，就缓/控释钾肥对烤烟生长发育、烟叶钾含量及品质性状、经济性状、土壤钾含量的影响作了综述，并且提出了当前研究中的一些问题。缓/控释钾肥能够促进烤烟的生长，提高土壤钾含量，进而提高烟叶钾含量，改善烟叶品质，增加产量产值，但也存在控释钾肥包膜材料和机理研究不足、与普通肥配施研究较少等问题，因此有必要就缓/控释钾肥在国内外的发展现状、前景、存在问题及对策予以讨论，以期为我国缓/控释钾肥产业化提供理论依据。
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昆虫抗药性检测方法研究进展
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马玉婷,魏娟,李相敢
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2017 Vol. 7 (4):
272-278.
DOI:10.19586/j.2095-2341.2016.0153
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摘要 (
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随着杀虫剂被长期、广泛地使用，昆虫对杀虫剂产生了不同程度的抗性，昆虫抗药品种及抗药剂量也相应地逐年增加，这使得昆虫抗药性的监测逐渐成为人们关注的焦点，昆虫抗药性的检测方法也因此不断改进。介绍了检测昆虫抗药性的两类常见方法：生物测定法和分子生物学法，其中，生物测定法分为人工饲料混药法、浸叶法、点滴法、喷雾法及喷粉法、药膜法、浸虫法和IRAC No.5法；而分子生物学法又包括PCR限制性内切酶技术、特异性等位基因PCR技术、随机扩增多态性DNA技术、TaqMan实时荧光定量PCR技术、KASP技术和DNA测序技术。研究人员可通过比较昆虫特性、环境因素、实验条件及实验目的的不同，选择合适的检测方法，以快速掌握昆虫的抗性信息，并及时有效的调整昆虫的防治策略。
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稀有人参皂苷的酶转化研究进展
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郭枫,刘焕焕,邱智东,王伟楠
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2017 Vol. 7 (4):
279-283.
DOI:10.19586/j.2095-2341.2017.0017
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摘要 (
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人参皂苷是五加科人参属植物的主要活性成分之一。研究表明，人参皂苷经过体内代谢后生成的稀有皂苷在抗肿瘤、抗炎、抗衰老等方面的药理作用要强于原型皂苷，因此，稀有皂苷的制备成为目前人参研究领域的热点内容。人参皂苷的酶转化是稀有人参皂苷制备的主要途径之一，近些年取得了突破性的进展，以不同种类的糖苷酶为切入点，将相关研究内容进行了综述，分别讨论了不同类型的糖苷酶在稀有皂苷生物转化过程中的应用，以期为稀有皂苷的大规模开发利用奠定基础。
综述
研究论文
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抗虫耐除草剂转基因玉米SW-1目标性状测试及多重PCR检测
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张欣,董玉凤,王旭静,王志兴
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2017 Vol. 7 (4):
296-303.
DOI:10.19586/j.2095-2341.2016.0160
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摘要 (
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以转基因玉米IE034和12-5为亲本，通过杂交复合获得同时含有cry1Ie、cry1Ab/cry2Aj和G10evo-EPSPs基因的复合性状转基因玉米SW-1。农艺性状检测证明SW-1同时具有抗虫和耐除草剂的特性。通过引物特异性筛选、退火温度和引物浓度等条件优化，建立了SW-1的多重PCR检测体系。多重PCR检测体系所用的内标基因为zSSIIb，反应体积为30 μL，最佳退火温度为62℃，各引物加入量为0.3 μL（10 μmol/L）。利用此多重PCR检测体系，当产品中SW-1的质量百分比超过0.5% 时，目标基因cry1Ie、cry1Ab/cry2Aj和G10evo-EPSPs都能同时被检测出来。研究结果为复合性状转基因玉米SW-1的分子特征检测提供了良好的技术支撑，同时也为含有cry1Ie、cry1Ab/cry2Aj和G10evo-EPSPs基因的其他转化体的多重PCR检测提供了科学数据。
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意大利蝗血蓝蛋白亚基Ⅰ基因的克隆与原核表达
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王頔,张早,王张平,印红
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2017 Vol. 7 (4):
304-309.
DOI:10.19586/j.2095-2341.2017.0023
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摘要 (
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昆虫血蓝蛋白是在昆虫体内普遍存在的一种含Cu2+的多功能蛋白，除参与呼吸外还具有能量贮存、抗菌和抗病毒等多种生物学功能。为了研究意大利蝗（Calliptanus italicus）血蓝蛋白亚基CitHc-1的结构和表达，通过RACE技术获得了CitHc-1的全长cDNA（2 335 bp）序列，其中开放阅读框2 079 bp，编码692个氨基酸，预测蛋白分子量79.88 kDa。序列比对结果显示CitHc-1基因cDNA序列与蝗总科其他物种血蓝蛋白亚基Ⅰ的cDNA序列的相似性为91%~94%。利用MEGA的NJ法构建昆虫纲血蓝蛋白亚基Ⅰ系统发育树，结果显示意大利蝗CitHc-1与东亚飞蝗LmiHc-1血蓝蛋白遗传距离最近形成姐妹群。为了研究血蓝蛋白的结构和功能，成功构建了意大利蝗CitHc-1基因活性区域的原核表达载体。融合蛋白pEASY-E1-Hc分子量约为32 kDa，与预期值一致，为进一步分析意大利蝗C. italicus CitHc-1的功能提供了理论基础。
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海马总蛋白提取及其酶解条件优化
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胡佳瑶,张梅妍,王振灵,魏娜,高炳淼
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2017 Vol. 7 (4):
310-314.
DOI:10.19586/j.2095-2341.2017.0011
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摘要 (
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为了提取海马总蛋白并确定最佳的酶解条件，将海马粉碎后采用水提法提取海马总蛋白。分别选用木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶、中性蛋白酶和胰蛋白酶，在不同酶解pH、时间、温度和E/S条件下进行单因素和正交试验法对海马总蛋白的酶解条件进行优化。利用聚丙烯酰胺凝胶电泳和BCA法来分别检测不同条件下的酶解情况及其蛋白含量，根据蛋白水解度来确定其最佳的酶解条件。实验结果表明：从10 g干海马中提取总蛋白为1.056 g，蛋白浓度为0.106 g/mL。海马总蛋白的最佳水解酶为碱性蛋白酶，其最佳酶解条件为：pH 9,E/S为5%,温度为50℃,时间为3 h，获得海马总蛋白的最大水解度为96.9%。研究获得了海马总蛋白及其最佳酶解条件，并为海马多肽生物活性研究奠定了基础。
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拜赖青霉活性产物的抗真菌作用研究
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张楠楠,白净,张礼文,徐玉泉,王惠国,冯宝民
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2017 Vol. 7 (4):
315-319.
DOI:10.19586/j.2095-2341.2017.0020
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摘要 (
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采用平板对峙实验和生长速率法，筛选和测定拜赖青霉ACCC 30440对尖孢镰刀菌与大丽轮枝菌的抑制活性。结果表明，ACCC 30440的PDB发酵液和乙酸乙酯提取物均能够抑制尖孢镰刀菌与大丽轮枝菌的生长，含10%发酵液的培养基对尖孢镰刀菌与大丽轮枝菌的抑制率均达40%以上，含20%发酵液则可完全抑制这两株病原真菌的生长；ACCC 30440的乙酸乙酯提取物对尖孢镰刀菌与大丽轮枝菌的半抑制浓度分别为518.63 μg/mL和443.42 μg/mL。说明拜赖青霉ACCC 30440菌株能够产生抑制植物病原真菌生长的活性物质。
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玉米微孔淀粉制备止血剂研究
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边文海,刘成程,李倩,王超展,边六交
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2017 Vol. 7 (4):
320-326.
DOI:10.19586/j.2095-2341.2016.0126
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摘要 (
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为了制备玉米微孔淀粉止血剂，并对止血剂性能进行评价研究，采用酸酶序解法制备玉米微孔淀粉，测定其孔密度和吸水率，用动物创面出血模型检验其止血效果。研究结果显示，该方法所得微孔淀粉孔密度为3.4×104 /mm2，吸水率为156.98%，无病原微生物和内毒素；兔耳创面和兔肝脏创面完全止血时间分别在140 s和80 s之内，止血迅速、牢固，优于云南白药。研究结果表明，该微孔淀粉组织相容性良好，符合生物材料安全性的要求，可望开发为新型止血材料。
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灵芝酸枣仁胶囊改善睡眠的功能研究
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冯伟伟,吴美媛,邓春萌,王哑倩,茆广华,徐财泉,吴向阳
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2017 Vol. 7 (4):
327-330.
DOI:10.19586/j.2095-2341.2017.0012
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摘要 (
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为研究灵芝酸枣仁胶囊的改善睡眠功能，将ICR小鼠随机分为灵芝酸枣仁高、中、低剂量组和空白对照组，每组12只。人体推荐每公斤服用剂量为45 mg/kg·d，以此剂量的5倍、10倍和30倍，即每日以225 mg/kg BW、450 mg/kg BW和1 350 mg/kg BW经口灌胃30 d后，通过直接睡眠、延长戊巴比妥钠睡眠时间、巴比妥钠阈下剂量催眠和巴比妥钠睡眠潜伏期实验评价灵芝酸枣仁胶囊的改善睡眠作用。研究发现，与空白对照组相比，3个剂量组的直接睡眠实验结果皆为阴性（P>005）；与空白对照组相比，中剂量组小鼠延长戊巴比妥钠睡眠时间显著延长（P<0.05），而高剂量组小鼠戊巴比妥钠睡眠时间极显著延长（P<0.01）；与空白对照组相比，高剂量组小鼠的入睡只数具有显著差异（P<0.05），而睡眠潜伏期的小鼠只数具有极显著差异（P<0.01）。研究表明，灵芝酸枣仁胶囊具有改善睡眠作用。
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DDX20基因对胃癌细胞迁移能力的调控作用
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刘骏,周春艳,金丽,陈钢,肖倩,朱焕章
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2017 Vol. 7 (4):
331-337.
DOI:10.19586/j.2095-2341.2017.0018
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摘要 (
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基于细胞划痕实验研究了DDX20基因对胃癌细胞迁移能力的调控作用。首先采用实时定量PCR检测人胃粘膜细胞GES、胃癌细胞MGC803、SGC7901和MKN74中DDX20基因的表达水平，确定DDX20基因高表达和低表达细胞株；进而针对DDX20基因设计、包被过表达并干扰慢病毒，基于实时定量PCR和Western Blot筛选稳定转染细胞株；基于稳定转染细胞株进行细胞划痕实验并采集图片。结果显示，与正常的胃粘膜细胞GES相比，DDX20基因在MGC803胃癌细胞中表达水平最高、MKN74胃癌细胞中表达水平次之、SGC7901胃癌细胞中表达水平最低。转染DDX20过表达慢病毒后，DDX20基因及蛋白表达水平显著增加；转染DDX20干扰慢病毒后，DDX20基因及蛋白表达水平显著降低，特别是转染干扰组2干扰慢病毒。过表达DDX20基因能显著促进胃癌细胞的迁移，抑制DDX20基因的表达可显著降低胃癌细胞的迁移。结果表明，DDX20基因是一个肿瘤转移相关基因，通过抑制该基因的表达能有效降低肿瘤细胞的迁移，为胃癌的临床治疗提供了一个潜在靶点，具有一定的临床应用价值。
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CRISPR/Cas9敲除pyk2基因对人脑胶质瘤细胞增殖、迁移及侵袭能力的影响
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汪超甲,王辉,胡钧涛,胡胜利,张宇强,成于思,雷尚国
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2017 Vol. 7 (4):
338-344.
DOI:10.19586/j.2095-2341.2017.0010
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摘要 (
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为了探讨富含脯氨酸的酪氨酸激酶（proline rich tyrosine kinase2，Pyk2）对人脑胶质瘤U251细胞增殖及侵袭能力的影响,设计了2对以pyk2为靶基因的sgRNA片段，以px335质粒为载体,构建CRISPR/Cas9重组质粒，转染至人脑胶质瘤U251细胞中，同时设置野生型U251细胞作为对照组。通过酶切鉴定及Western blot分析筛选阳性单克隆细胞，并测序揭示突变位点。筛选出的阳性单克隆细胞作为实验组，经RTCA法比较后，发现实验组细胞的增殖能力较对照组明显下降，且具有统计学意义（P<0.05）；Transwell小室法及划痕实验的结果均证实，较对照组，实验组细胞的体外侵袭及迁移能力受到明显的抑制，差异显著（P<0.05）。作为验证侵袭能力的代表，基质金属蛋白酶9（matrix metalloprotein 9，MMP9）在Western blot实验中表达量较对照组也明显下降。通过上述方法成功得到目的基因敲除的稳定细胞株，并证实敲除pyk2基因能明显的抑制人脑胶质瘤细胞的增殖、迁移及侵袭能力。
技术与方法
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正交实验法优化超临界二氧化碳萃取桑叶总黄酮
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谢玉龙,石仝雨,缪伟伟,王志雄,
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2017 Vol. 7 (4):
345-349.
DOI:10.19586/j.2095-2341.2016.0127
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摘要 (
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探索采用超临界CO2法萃取桑叶中总黄酮提取的最佳方案。利用超临界二氧化碳萃取技术，依次用正交实验方法考查萃取压强、萃取温度、萃取时间以及夹带剂流速对于桑叶中总黄酮得率的影响，优选提取桑叶黄酮类化合物提取的最佳工艺条件。结果显示，正交实验的最佳萃取条件为：萃取压强为25 MPa，萃取温度为40℃，萃取时间为3 h，夹带剂无水乙醇流速为2.5 mL/min，该条件下，总黄酮得率为6.19%±026%，可重复性良好。采用超临界二氧化碳萃取桑叶中黄酮类物质的总黄酮提取率较高，为进一步开发桑叶实验提供了理论和实验依据。
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