转基因耐除草剂大豆LP012-1转化体普通PCR定性检测方法的研究

doi:10.19586/j.2095-2341.2024.0207

生物技术进展 ›› 2025, Vol. 15 ›› Issue (3): 466-475.DOI: 10.19586/j.2095-2341.2024.0207

转基因耐除草剂大豆LP012-1转化体普通PCR定性检测方法的研究

张月秋¹(), 傅芳奇¹, 赵桐桐¹, 陈子言¹, 裴欣瑶¹, 高芳瑞¹, 李佳岢¹, 李辉², 江晓丹¹, 王颢潜¹(), 陈红¹()

^1.农业农村部科技发展中心，北京　100176
^2.四川省农业科学院质量标准与检测技术研究所，成都　610000

收稿日期:2024-12-27 接受日期:2025-02-12 出版日期:2025-05-25 发布日期:2025-07-01
通讯作者: 王颢潜,陈红
作者简介:张月秋 E-mail: zhangyueqiu903@163.com
基金资助:
农业生物育种国家科技重大专项(2022ZD04020)

Development of PCR Qualitative Method for Genetically Modified Herbicide-tolerant Soyabean LP012-1

Yueqiu ZHANG¹(), Fangqi FU¹, Tongtong ZHAO¹, Ziyan CHEN¹, Xinyao PEI¹, Fangrui GAO¹, Jiake LI¹, Hui LI², Xiaodan JIANG¹, Haoqian WANG¹(), Hong CHEN¹()

^1.Development Center of Science and Technology，Ministry of Agriculture and Rural Affairs，Beijing 100176，China
^2.Institute of Quality Standard and Testing Technology Research，Sichuan Academy of Agricultural Sciences，Chengdu 610000，China

Received:2024-12-27 Accepted:2025-02-12 Online:2025-05-25 Published:2025-07-01
Contact: Haoqian WANG,Hong CHEN

摘要/Abstract

摘要：

转基因耐除草剂大豆LP012-1转化体由我国企业自主研发，具有广阔的生物育种产业化应用前景。通过建立LP012-1转化体的定性检测方法，可为标识管理和安全监管提供有力支撑。基于此，从优化DNA提取方法、设计转化体特异性引物并优化引物浓度和退火温度、验证方法特异性、测试检出限以及其稳健性等方面构建LP012-1转化体的普通PCR定性检测方法。研究建立了灵敏度高、特异性好的LP012-1转化体检测方法，填补了该转化体定性检测方法的空白，可为后期的规范管理和推广应用提供支持。

关键词: 转基因耐除草剂大豆, PCR定性检测, LP012-1转化体

Abstract:

Genetically modified herbicide-tolerant soybean transformant LP012-1 was independently developed by Chinese enterprises and has broad application prospects with biological breeding industrialization. By establishing a qualitative detection method for LP012-1 transformants， strong support can be provided for label management and safety supervision. Based on this， a general PCR qualitative detection method for LP012-1 transformants was constructed from optimizing DNA extraction methods， designing transformant specific primers， optimizing primer concentration and annealing temperature， verifying method specificity， testing detection limits， and its robustness. The establishment of a highly sensitive and specific LP012-1 transformant detection method fills the gap in qualitative detection methods for this transformant， and can provide support for standardized management and promotion of application in the later stage.

Key words: genetically modified herbicide-tolerant soybean, PCR qualitative detection, transformant LP012-1

中图分类号:

Q786

张月秋, 傅芳奇, 赵桐桐, 陈子言, 裴欣瑶, 高芳瑞, 李佳岢, 李辉, 江晓丹, 王颢潜, 陈红. 转基因耐除草剂大豆LP012-1转化体普通PCR定性检测方法的研究[J]. 生物技术进展, 2025, 15(3): 466-475.

Yueqiu ZHANG, Fangqi FU, Tongtong ZHAO, Ziyan CHEN, Xinyao PEI, Fangrui GAO, Jiake LI, Hui LI, Xiaodan JIANG, Haoqian WANG, Hong CHEN. Development of PCR Qualitative Method for Genetically Modified Herbicide-tolerant Soyabean LP012-1[J]. Current Biotechnology, 2025, 15(3): 466-475.

图/表 11

表1 混合样品成分表

Table 1 Components table of genetically modified mixed sample

样品	成分	混合方式
转基因大豆混合样	中黄6106、GTS40-3-2、MON89788、FG72、A5547-127、A2704-12、356043、305423、CV127、CAL16、MON87701、MON87708、MON87769、MON87705、DAS81419-2、DAS-444Ø6-6、MON87751、SHZD3201、DBN9004	转化体混合物质量分数为1%
转基因玉米混合样	MON810、MON863、GA21、NK603、Bt11、Bt176、T25、MON89034、MON88017、59122、MIR604、DBN9501、瑞丰125、MON87460、DAS40278-9、4114、MON87427、5307、3272、DBN9858、ND207、DBN9936、MON87411、MZIR098、浙大瑞丰8、BFL4-2、TC1507、nCX-1	转化体混合物质量分数为1%
转基因水稻混合样	TT51-1、KF-6、KMD-1、M12、KF-8、KF-2、G6H1、T1C-19	转化体混合物质量分数为1%
转基因油菜混合样	MS1、MS8、RF1、RF2、RF3、T45、Oxy235、Topas19/2、MON88302、73496	10个转化体混合物质量分数为1%
转基因棉花混合样	MON1445、MON531、MON15985、LLCOTTON25、MON88913、GHB614、COT102	转化体混合物质量分数为1%

表2 引物序列信息表

Table 2 List of the sequence of primers

序号	名称	序列（5' $→$ 3'）	扩增长度/bp	来源
组合1	LP012-1-RB-F1	5'-AGCTCAGCACAAGCTGGAATA-3'	224	自行设计
组合1	LP012-1-RB-R1	5'-CAGATTGTCGTTTCCCGCC-3'	224	自行设计
组合2	LP012-1-RB-F1	5'-AGCTCAGCACAAGCTGGAATA-3'	262	自行设计
组合2	LP012-1-RB-R2	5'-GGGTCATAACGTGACTCCCTT-3'	262	自行设计
组合3	LP012-1-RB-F1	5'-AGCTCAGCACAAGCTGGAATA-3'	291	自行设计
组合3	LP012-1-RB-R4	5'-TAAAACGGCTTGTCCCGCGT-3'	291	自行设计
组合4	LP012-1-RB-F2	5'-AAACGGTGGAAGCAGGGTC-3'	192	自行设计
组合4	LP012-1-RB-R3	5'-GCGTTGCGGTTCTGTCAGTT-3'	192	自行设计
组合5	LP012-1-RB-F3	5'-AGGTGAAGGAACAGAAACGGT-3'	206	自行设计
组合5	LP012-1-RB-R3	5'-GCGTTGCGGTTCTGTCAGTT-3'	206	自行设计
组合6	LP012-1-LB-F1	5'-GGCCGCCTACTTAGTCAAGA-3'	229	自行设计
组合6	LP012-1-LB-R1	5'-CCTAAACACACTATGCCTGACCT-3'	229	自行设计
组合7	LP012-1-LB-F1	5'-GGCCGCCTACTTAGTCAAGA-3'	249	自行设计
组合7	LP012-1-LB-R2	5'-TTGCTCTGGATCACAACTTACCT-3'	249	自行设计
组合8	LP012-1-LB-F1	5'-GGCCGCCTACTTAGTCAAGA-3'	231	自行设计
组合8	LP012-1-LB-R3	5'-TACCTAAACACACTATGCCTGACC-3'	231	自行设计
组合9	LP012-1-LB-F1	5'-GGCCGCCTACTTAGTCAAGA-3'	224	自行设计
组合9	LP012-1-LB-R4	5'-ACACACTATGCCTGACCTATCTC-3'	224	自行设计
组合10	LP012-1-LB-F2	5'-CGTACCTGCAGGGAATTCTT-3'	263	自行设计
组合10	LP012-1-LB-R1	5'-CCTAAACACACTATGCCTGACCT-3'	263	自行设计
组合11	LP012-1-LB-F2	5'-CGTACCTGCAGGGAATTCTT-3'	283	自行设计
组合11	LP012-1-LB-R2	5'-TTGCTCTGGATCACAACTTACCT-3'	283	自行设计
组合12	LP012-1-LB-F2	5'-CGTACCTGCAGGGAATTCTT-3'	265	自行设计
组合12	LP012-1-LB-R3	5'-TACCTAAACACACTATGCCTGACC-3'	265	自行设计
组合13	LP012-1-LB-F2	5'-CGTACCTGCAGGGAATTCTT-3'	258	自行设计
组合13	LP012-1-LB-R4	5'-ACACACTATGCCTGACCTATCTC-3'	258	自行设计
组合14	LP012-1-LB-F3	5'-CCTACTTAGTCAAGAGCCTCGC-3'	224	自行设计
组合14	LP012-1-LB-R1	5'-CCTAAACACACTATGCCTGACCT-3'	224	自行设计
组合15	LP012-1-LB-F3	5'-CCTACTTAGTCAAGAGCCTCGC-3'	244	自行设计
组合15	LP012-1-LB-R2	5'-TTGCTCTGGATCACAACTTACCT-3'	244	自行设计
组合16	LP012-1-LB-F3	5'-CCTACTTAGTCAAGAGCCTCGC-3'	226	自行设计
组合16	LP012-1-LB-R3	5'-TACCTAAACACACTATGCCTGACC-3'	226	自行设计
序号	名称	序列（5' $→$ 3'）	扩增长度/bp	来源
组合17	LP012-1-LB-F3	5'-CCTACTTAGTCAAGAGCCTCGC-3'	219	自行设计
组合17	LP012-1-LB-R4	5'-ACACACTATGCCTGACCTATCTC-3'	219	自行设计
组合18	LP012-1-LB-F4	5'-CCGCCTACTTAGTCAAGAGCC-3'	227	自行设计
组合18	LP012-1-LB-R1	5'-CCTAAACACACTATGCCTGACCT-3'	227	自行设计
组合19	LP012-1-LB-F4	5'-CCGCCTACTTAGTCAAGAGCC-3'	247	自行设计
组合19	LP012-1-LB-R2	5'-TTGCTCTGGATCACAACTTACCT-3'	247	自行设计
组合20	LP012-1-LB-F4	5'-CCGCCTACTTAGTCAAGAGCC-3'	229	自行设计
组合20	LP012-1-LB-R3	5'-TACCTAAACACACTATGCCTGACC-3'	229	自行设计
组合21	LP012-1-LB-F4	5'-CCGCCTACTTAGTCAAGAGCC-3'	222	自行设计
组合21	LP012-1-LB-R4	5'-ACACACTATGCCTGACCTATCTC-3'	222	自行设计
组合22	LP012-1-RBGMO-F	5'-GCTGGAATAATCTCAATGACAACC-3'	235	研发者提供
组合22	LP012-1-RBGMO-R	5'-TCCCTTAATTCTCCGCTCTTG-3'	235	研发者提供

表2 引物序列信息表

Table 2 List of the sequence of primers

序号	名称	序列（5' $→$ 3'）	扩增长度/bp	来源
组合1	LP012-1-RB-F1	5'-AGCTCAGCACAAGCTGGAATA-3'	224	自行设计
组合1	LP012-1-RB-R1	5'-CAGATTGTCGTTTCCCGCC-3'	224	自行设计
组合2	LP012-1-RB-F1	5'-AGCTCAGCACAAGCTGGAATA-3'	262	自行设计
组合2	LP012-1-RB-R2	5'-GGGTCATAACGTGACTCCCTT-3'	262	自行设计
组合3	LP012-1-RB-F1	5'-AGCTCAGCACAAGCTGGAATA-3'	291	自行设计
组合3	LP012-1-RB-R4	5'-TAAAACGGCTTGTCCCGCGT-3'	291	自行设计
组合4	LP012-1-RB-F2	5'-AAACGGTGGAAGCAGGGTC-3'	192	自行设计
组合4	LP012-1-RB-R3	5'-GCGTTGCGGTTCTGTCAGTT-3'	192	自行设计
组合5	LP012-1-RB-F3	5'-AGGTGAAGGAACAGAAACGGT-3'	206	自行设计
组合5	LP012-1-RB-R3	5'-GCGTTGCGGTTCTGTCAGTT-3'	206	自行设计
组合6	LP012-1-LB-F1	5'-GGCCGCCTACTTAGTCAAGA-3'	229	自行设计
组合6	LP012-1-LB-R1	5'-CCTAAACACACTATGCCTGACCT-3'	229	自行设计
组合7	LP012-1-LB-F1	5'-GGCCGCCTACTTAGTCAAGA-3'	249	自行设计
组合7	LP012-1-LB-R2	5'-TTGCTCTGGATCACAACTTACCT-3'	249	自行设计
组合8	LP012-1-LB-F1	5'-GGCCGCCTACTTAGTCAAGA-3'	231	自行设计
组合8	LP012-1-LB-R3	5'-TACCTAAACACACTATGCCTGACC-3'	231	自行设计
组合9	LP012-1-LB-F1	5'-GGCCGCCTACTTAGTCAAGA-3'	224	自行设计
组合9	LP012-1-LB-R4	5'-ACACACTATGCCTGACCTATCTC-3'	224	自行设计
组合10	LP012-1-LB-F2	5'-CGTACCTGCAGGGAATTCTT-3'	263	自行设计
组合10	LP012-1-LB-R1	5'-CCTAAACACACTATGCCTGACCT-3'	263	自行设计
组合11	LP012-1-LB-F2	5'-CGTACCTGCAGGGAATTCTT-3'	283	自行设计
组合11	LP012-1-LB-R2	5'-TTGCTCTGGATCACAACTTACCT-3'	283	自行设计
组合12	LP012-1-LB-F2	5'-CGTACCTGCAGGGAATTCTT-3'	265	自行设计
组合12	LP012-1-LB-R3	5'-TACCTAAACACACTATGCCTGACC-3'	265	自行设计
组合13	LP012-1-LB-F2	5'-CGTACCTGCAGGGAATTCTT-3'	258	自行设计
组合13	LP012-1-LB-R4	5'-ACACACTATGCCTGACCTATCTC-3'	258	自行设计
组合14	LP012-1-LB-F3	5'-CCTACTTAGTCAAGAGCCTCGC-3'	224	自行设计
组合14	LP012-1-LB-R1	5'-CCTAAACACACTATGCCTGACCT-3'	224	自行设计
组合15	LP012-1-LB-F3	5'-CCTACTTAGTCAAGAGCCTCGC-3'	244	自行设计
组合15	LP012-1-LB-R2	5'-TTGCTCTGGATCACAACTTACCT-3'	244	自行设计
组合16	LP012-1-LB-F3	5'-CCTACTTAGTCAAGAGCCTCGC-3'	226	自行设计
组合16	LP012-1-LB-R3	5'-TACCTAAACACACTATGCCTGACC-3'	226	自行设计
序号	名称	序列（5' $→$ 3'）	扩增长度/bp	来源
组合17	LP012-1-LB-F3	5'-CCTACTTAGTCAAGAGCCTCGC-3'	219	自行设计
组合17	LP012-1-LB-R4	5'-ACACACTATGCCTGACCTATCTC-3'	219	自行设计
组合18	LP012-1-LB-F4	5'-CCGCCTACTTAGTCAAGAGCC-3'	227	自行设计
组合18	LP012-1-LB-R1	5'-CCTAAACACACTATGCCTGACCT-3'	227	自行设计
组合19	LP012-1-LB-F4	5'-CCGCCTACTTAGTCAAGAGCC-3'	247	自行设计
组合19	LP012-1-LB-R2	5'-TTGCTCTGGATCACAACTTACCT-3'	247	自行设计
组合20	LP012-1-LB-F4	5'-CCGCCTACTTAGTCAAGAGCC-3'	229	自行设计
组合20	LP012-1-LB-R3	5'-TACCTAAACACACTATGCCTGACC-3'	229	自行设计
组合21	LP012-1-LB-F4	5'-CCGCCTACTTAGTCAAGAGCC-3'	222	自行设计
组合21	LP012-1-LB-R4	5'-ACACACTATGCCTGACCTATCTC-3'	222	自行设计
组合22	LP012-1-RBGMO-F	5'-GCTGGAATAATCTCAATGACAACC-3'	235	研发者提供
组合22	LP012-1-RBGMO-R	5'-TCCCTTAATTCTCCGCTCTTG-3'	235	研发者提供

表3 L9(34)正交表

Table 3 L9(34) orthogonal table

试验号	A:水浴裂解时间（加入RNase A后）/min	B:组织离心速度/(r·min^-1)	C:AE洗脱前，晾干时间/min	D:AE洗脱后，室温放置时间/min	DNA浓度/(ng·μL^-1)
1	10	6 000	0	5	105.30
2	10	10 000	10	10	101.95
3	10	14 000	20	20	113.15
4	30	6 000	0	5	104.05
5	30	10 000	10	10	110.45
6	30	14 000	20	20	113.20
7	60	6 000	0	5	130.30
8	60	10 000	10	10	127.55
9	60	14 000	20	20	113.70

图1 LP012-1转化体的22对引物筛选结果注：M—DL1000 maker；孔道1、2、9、10、17、18：空白对照；孔道3、4、11、12、19、20：阴性对照；孔道5、6、13、14、21、22：0.1% LP012-1基因组DNA；孔道7、8、15、16、23、24：1% LP012-1基因组DNA；图中标注的组合1~22对应表2中的引物组合序号。

Fig. 1 Screening result of 22 pairs of LP012-1 transformant primers

图2 LP012-1转化体引物特异性测试A: 内标准基因的PCR扩增； B： LP012-1-LBF4/R1引物的PCR扩增；1~2：空白对照；3~4：阴性对照；5~6：阳性对照；7~8：1%LP012-1；9~10：非转基因大豆混合样品；11~12：转基因玉米混合样品；13~14：转基因水稻混合样品；15~16：转基因油菜混合样品；17~18：转基因棉花混合样品；19~20：非转基因大豆混合样品；M—DL2000 maker。

Fig. 2 Specification test of LP012-1 transformant primers

图3 LP012-1转化体引物浓度优化注：M—DL1000 maker；泳道1~2：空白对照；泳道3~4：阴性对照；泳道5~6阳性对照：泳道7~8：1% LP012-1转化体。

Fig. 3 Concentration optimization of LP012-1 transformant

图4 LP012-1转化体退火温度优化A： LP012-1-LBF4/R1退火温度优化；B：内标准基因（210 bp）扩增；1~3：空白对照；4~6：阴性对照；7~9：64.1 ℃；10~12：62.4 ℃；13~15：60.5 ℃；16~18：58.0 ℃；19~21：56.1 ℃；22~24：54.1 ℃； M—DL1000 maker。

Fig. 4 Annealing temperature optimization of LP012-1 transformant

图5 LP012-1转化体检出限测试A: LP012-1-LBF4/R1引物扩增；B: 内标准基因Lectin扩增；1~3：空白对照；4~6：阴性对照；7~9阳性对照：10~12：LP012-1转化体拷贝数比值1%；13~15：LP012-1转化体拷贝数比值0.5%；16~18：LP012-1转化体拷贝数比值0.1%；19~21：LP012-1转化体拷贝数比值0. 05%；22~24：LP012-1转化体拷贝数比值0.01%；M—DL2000 maker。

Fig. 5 Limit of detection test of LP012-1 transformant

图6 LP012-1转化体检出限确认A: 内标准基因Lectin扩增； B: LP012-1-LBF4/R1引物扩增；M—DL2000 maker；1~3：空白对照；4~6阴性对照；7~66：0.1% LP012-1大豆转化体

Fig. 6 Limit of detection confirmation of LP012-1 transformant

图7 LP012-1转化体稳健性测试A: PCR仪1稳健性测试； B: PCR仪2稳健性测试

Fig. 7 Robustness test of LP012-1 transformant

表4 LP012-1转化体检出限室间测试结果

Table 4 LOD test re-confirmation result of LP012-1 transformant from 8 authoritative test center

样品	实验室1	实验室2	实验室3	实验室4	实验室5	实验室6	实验室7	实验室8
0.05% LP012-1转化体	+	+	+	+	+	+	+	+
其他转基因大豆混合样	-	-	-	-	-	-	-	-
转基因玉米混合样	-	-	-	-	-	-	-	-
转基因棉花混合样	-	-	-	-	-	-	-	-
转基因水稻混合样	-	-	-	-	-	-	-	-
转基因油菜混合样	-	-	-	-	-	-	-	-

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转基因耐除草剂大豆LP012-1转化体普通PCR定性检测方法的研究

Development of PCR Qualitative Method for Genetically Modified Herbicide-tolerant Soyabean LP012-1

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