植物内生菌定殖检测技术及其应用

doi:10.19586/j.2095-2341.2022.0105

生物技术进展 ›› 2023, Vol. 13 ›› Issue (1): 55-64.DOI: 10.19586/j.2095-2341.2022.0105

植物内生菌定殖检测技术及其应用

唐广宣¹^,²(), 何莉薇¹^,², 陈泳妤², 张佳研¹, 戴雅琪², 吕辉雄², 刘丽辉¹^,³()

^1.暨南大学生命科学技术学院，广州 510632
^2.华南农业大学资源环境学院，广州 510642
^3.广东药科大学生命科学与生物制药学院，广州 510006

收稿日期:2022-06-17 接受日期:2022-10-09 出版日期:2023-01-25 发布日期:2023-02-07
通讯作者: 刘丽辉
作者简介:唐广宣 E-mail:19927534378@163.com；
基金资助:
国家自然科学基金项目(41907301);广东省科技创新战略专项资金（“攀登计划”专项资金）项目(pdjh2021b0085)

Techniques on Colonization and Detection of Plant Endophytes and its Application

Guangxuan TANG¹^,²(), Liwei HE¹^,², Yongyu CHEN², Jiayan ZHANG¹, Yaqi DAI², Huixiong LV², Lihui LIU¹^,³()

^1.College of Life Science and Technology，Jinan University，Guangzhou 510632，China
^2.College of Natural Resources and Environment，South China Agricultural University，Guangzhou 510642，China
^3.College of Life Science and Biopharmaceutical，Guangdong Pharmaceutical University，Guangzhou 510006，China

Received:2022-06-17 Accepted:2022-10-09 Online:2023-01-25 Published:2023-02-07
Contact: Lihui LIU

摘要/Abstract

摘要：

自然环境中内生菌定殖于植物体内，对宿主植物产生多种有益效应，但是内生菌定殖情况难以检测，相关研究不够深入系统。目前在该领域使用较为广泛的检测技术包括：荧光标记、抗生素标记、荧光定量PCR和高通量测序等。内生菌通过孔隙伤口和降解细胞壁等方式侵染植物，通过种子垂直传递核心内生菌。对植物内生菌定殖的侵染方式、定殖方法和检测技术进行了归纳和整理，介绍了内生菌多种侵染和迁移途径，总结了目前内生菌定殖在生物防治、促进植物生长和污染修复等方面的功能，综述了多种检测方式在应用中的特点，以期为内生菌定殖植物的相关研究及其应用提供参考依据。

关键词: 内生菌, 侵染途径, 定殖检测技术, 防治与促生

Abstract:

In the natural environment， the colonization of endophyte in plants produce a variety of beneficial effects on host plants， but endophyte colonization is difficult to detect， and the related research is not deep and systematic. At present， the widely used detection techniques in this field include fluorescence labeling， antibiotic labeling， fluorescent quantitative PCR， high throughput sequencing， and so on. Endophytes infect plants through pore wounds and the degraded cell walls， transmitting core endophytes vertically through seeds. In this paper， the infection methods and colonization methods of plant endophytes were summarized. The paper also introduced various ways of infection and migration of endophytes， and summarized the functions of endophyte colonization in biological control， promoting plant growth and remediation of polluted environment. The characteristics of various detection methods in the application were reviewed， the paper was expected to provide reference basis for the related research and application of endophytic bacteria colonizing plants.

Key words: endophytes, infection route, colonization detection technology, control and growth promotion

中图分类号:

Q934.3

唐广宣, 何莉薇, 陈泳妤, 张佳研, 戴雅琪, 吕辉雄, 刘丽辉. 植物内生菌定殖检测技术及其应用[J]. 生物技术进展, 2023, 13(1): 55-64.

Guangxuan TANG, Liwei HE, Yongyu CHEN, Jiayan ZHANG, Yaqi DAI, Huixiong LV, Lihui LIU. Techniques on Colonization and Detection of Plant Endophytes and its Application[J]. Current Biotechnology, 2023, 13(1): 55-64.

图/表 2

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方式	原理	特点	应用
通过宿主的气孔、擦伤口、切口等通道侵染	根部接种内生菌的主要入侵途径是通过根系与土壤等摩擦而造成的伤口进入；茎部接种则是以茎干上的皮孔、蜜腺等作为通道；叶部则是通过气孔、水孔等^[9]	用于定殖研究中较为便捷的侵染方式	根部侵染法：伤根法、灌根法、浸根法、蘸根法；茎干侵染法：打孔法、针刺法；叶片：伤叶法、喷雾法。有研究采用喷雾和灌根相结合的方法，用枯草芽孢杆菌Y13（Bacillus subtilis 13）侵染油茶^[10]
内生菌分泌酶来降解宿主细胞纤维素	通过代谢产生细胞壁降解酶等物质对局部细胞壁进行降解；内生菌穿过内胚层的裂纹，移动进入木质部，进而帮助细菌侵入和定殖^[5]	属于植物的原始自身操作方式，内生菌不受植物体外其他因素影响	如蓝细菌（Brasilonema）能分泌破坏植物细胞壁的水解酶进而侵入植物体内
通过种子的垂直传递定殖	内生菌与宿主可协同进化，参与宿主的生长、繁衍，伴随着种子的萌发，通过种子的垂直传递将内生菌从亲本传到后代	宿主种子的表面普遍带有独特的共生微生物群落，会影响种子的萌发、生长和宿主健康，也是植物内生菌垂直传播的一种方式	种子内生菌的垂直传递规律用于现代生物育种中，有研究使用内生细菌PW7悬液处理黑麦草（Lolium multiflorum L.）种子进行浸种定殖^[11]

方式	原理	特点	应用
通过宿主的气孔、擦伤口、切口等通道侵染	根部接种内生菌的主要入侵途径是通过根系与土壤等摩擦而造成的伤口进入；茎部接种则是以茎干上的皮孔、蜜腺等作为通道；叶部则是通过气孔、水孔等^[9]	用于定殖研究中较为便捷的侵染方式	根部侵染法：伤根法、灌根法、浸根法、蘸根法；茎干侵染法：打孔法、针刺法；叶片：伤叶法、喷雾法。有研究采用喷雾和灌根相结合的方法，用枯草芽孢杆菌Y13（Bacillus subtilis 13）侵染油茶^[10]
内生菌分泌酶来降解宿主细胞纤维素	通过代谢产生细胞壁降解酶等物质对局部细胞壁进行降解；内生菌穿过内胚层的裂纹，移动进入木质部，进而帮助细菌侵入和定殖^[5]	属于植物的原始自身操作方式，内生菌不受植物体外其他因素影响	如蓝细菌（Brasilonema）能分泌破坏植物细胞壁的水解酶进而侵入植物体内
通过种子的垂直传递定殖	内生菌与宿主可协同进化，参与宿主的生长、繁衍，伴随着种子的萌发，通过种子的垂直传递将内生菌从亲本传到后代	宿主种子的表面普遍带有独特的共生微生物群落，会影响种子的萌发、生长和宿主健康，也是植物内生菌垂直传播的一种方式	种子内生菌的垂直传递规律用于现代生物育种中，有研究使用内生细菌PW7悬液处理黑麦草（Lolium multiflorum L.）种子进行浸种定殖^[11]

方法	优点	缺点	应用
荧光蛋白标记法	后续操作简单，可直接观察，能够长时间且稳定地标记，保持荧光时不会对生物体功能产生影响^[26]	标记基因重组到质粒上表达的不稳定性较高，并且成功率不高。相比之下，重组到基因组的稳定性较高。此外，将重组DNA导入革兰氏阳性菌的难度较阴性菌更大	受荧光蛋白基因的导入方式、菌株侵染标记方式和定殖检测方式等影响，包括使用绿色荧光蛋白标记菌株YN28-P43GFPmut3a，观测其在烟草体内的定殖量及分布^[51]
抗生素标记法	易于分析统计、消耗低、快速、适用范围广等	定量不准确、准确率低、回收下限较高且易出现抗生素屏蔽现象	该法是一种常用的定殖检测手段，已从单抗生素标记发展到了多种抗生素同时标记，广泛应用于生物防治植物病害中。例如以拮抗病原真菌双抗性和抗利福平为标记，对辣椒体内的枯草芽孢杆菌BS-2（Bacillus subtilis BS-2）定殖情况进行观测^[53]
实时荧光定量PCR法	检测方便、反应迅速、灵敏度高、自动化高，可以很好地分析目标菌株定殖过程中发挥特殊作用的基因	对设备要求较高，并且会产生气溶胶污染问题，从而导致出现假阳性，影响结果的准确性和特异性^[54]	广泛应用于内生菌的定殖检测中。如DaSilva等^[55]利用实时荧光定量PCR筛选出适用于甘薯不同组织的内生菌基因
高通量测序法	灵敏度高、可操作性强，能够精准解析目标菌株的代谢途径和功能基因。通过测序也可以检测受体植株的微生物群落和丰度	成本高、后续需分析大量数据等	从遗传水平上对菌株进行解读，探索内生菌在宿主植物体内的功能基因、代谢路径、定殖机制等，例如利用高通量测序法，确定R-13菌能否成功定殖于龙葵体内^[42]
特异性寡合核苷酸片段标记法	灵敏度高、特异性强，大大地提高了实验的准确率和效率	基因结构的高度多态性造成可操作性差	发展出了寡核苷酸探针双标记荧光原位杂交技术（DOPE-FISH）和芯片标记技术，这些技术可以更加精准地检测目标菌株在宿主体内的定殖情况

方法	优点	缺点	应用
荧光蛋白标记法	后续操作简单，可直接观察，能够长时间且稳定地标记，保持荧光时不会对生物体功能产生影响^[26]	标记基因重组到质粒上表达的不稳定性较高，并且成功率不高。相比之下，重组到基因组的稳定性较高。此外，将重组DNA导入革兰氏阳性菌的难度较阴性菌更大	受荧光蛋白基因的导入方式、菌株侵染标记方式和定殖检测方式等影响，包括使用绿色荧光蛋白标记菌株YN28-P43GFPmut3a，观测其在烟草体内的定殖量及分布^[51]
抗生素标记法	易于分析统计、消耗低、快速、适用范围广等	定量不准确、准确率低、回收下限较高且易出现抗生素屏蔽现象	该法是一种常用的定殖检测手段，已从单抗生素标记发展到了多种抗生素同时标记，广泛应用于生物防治植物病害中。例如以拮抗病原真菌双抗性和抗利福平为标记，对辣椒体内的枯草芽孢杆菌BS-2（Bacillus subtilis BS-2）定殖情况进行观测^[53]
实时荧光定量PCR法	检测方便、反应迅速、灵敏度高、自动化高，可以很好地分析目标菌株定殖过程中发挥特殊作用的基因	对设备要求较高，并且会产生气溶胶污染问题，从而导致出现假阳性，影响结果的准确性和特异性^[54]	广泛应用于内生菌的定殖检测中。如DaSilva等^[55]利用实时荧光定量PCR筛选出适用于甘薯不同组织的内生菌基因
高通量测序法	灵敏度高、可操作性强，能够精准解析目标菌株的代谢途径和功能基因。通过测序也可以检测受体植株的微生物群落和丰度	成本高、后续需分析大量数据等	从遗传水平上对菌株进行解读，探索内生菌在宿主植物体内的功能基因、代谢路径、定殖机制等，例如利用高通量测序法，确定R-13菌能否成功定殖于龙葵体内^[42]
特异性寡合核苷酸片段标记法	灵敏度高、特异性强，大大地提高了实验的准确率和效率	基因结构的高度多态性造成可操作性差	发展出了寡核苷酸探针双标记荧光原位杂交技术（DOPE-FISH）和芯片标记技术，这些技术可以更加精准地检测目标菌株在宿主体内的定殖情况

[1]	侯旭,张国庆,胡晓,闫立春,刘悦萍. 果树内生生防菌研究进展[J]. 生物技术进展, 2017, 7(2): 149-154.
[2]	马莉莉,宋培勇. 紫杉醇产生菌生物多样性研究进展[J]. 生物技术进展, 2016, 6(6): 462-468.
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植物内生菌定殖检测技术及其应用

Techniques on Colonization and Detection of Plant Endophytes and its Application

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