抗虫玉米CM8101定性检测方法的建立

doi:10.19586/j.2095-2341.2021.0158

生物技术进展 ›› 2022, Vol. 12 ›› Issue (2): 248-255.DOI: 10.19586/j.2095-2341.2021.0158

抗虫玉米CM8101定性检测方法的建立

温洪涛¹(), 杨洋¹(), 丁一佳¹, 苑冉¹, 张瑞英¹, 徐志远²(), 梁晋刚³()

^1.黑龙江省农业科学院农产品质量安全研究所，哈尔滨 150086
^2.东北农业大学农学院，哈尔滨 150038
^3.农业农村部科技发展中心，北京 100176

收稿日期:2021-09-23 接受日期:2021-10-22 出版日期:2022-03-25 发布日期:2022-03-25
通讯作者: 徐志远,梁晋刚
作者简介:温洪涛与杨洋为本文共同第一作者。温洪涛E-mail：wen0891@163.com
杨洋E-mail：yangy_yx@163.com
基金资助:
国家转基因新品种培育重大专项(2018ZX08011-04B)

Establishment of Qualitative PCR Detection of Transgenic Insect⁃resistant Maize CM8101

Hongtao WEN¹(), Yang YANG¹(), Yijia DING¹, Ran YUAN¹, Ruiying ZHANG¹, Zhiyuan XU²(), Jingang LIANG³()

^1.Quality & Safety Institute of Agricultural Products，Heilongjiang Academy of Agricultural Sciences，Harbin 150086，China
^2.College of Agriculture，Northeast Agricultural University，Harbin 150038，China
^3.Development Center of Science and Technology，Ministry of Agriculture and Rural Affairs，Beijing 100176，China

Received:2021-09-23 Accepted:2021-10-22 Online:2022-03-25 Published:2022-03-25
Contact: Zhiyuan XU,Jingang LIANG

摘要/Abstract

摘要：

转基因抗虫玉米CM8101是经人工改造合成的转Bt抗虫基因Cry1Ab?Ma转基因玉米新品系，由我国自主研发，具有更优良的抗虫性，目前已进入生产性试验阶段，具有广阔的产业化应用前景。依据CM8101的5′端旁侧序列信息，设计并筛选出最佳引物探针组合，通过普通PCR和实时荧光PCR技术，建立了转基因抗虫玉米CM8101的两种特异性定性检测方法。结果显示，普通PCR检测方法检出限达0.1%，实时荧光PCR检测方法检出限达0.05%。这两种定性检测方法的建立为今后准确高效检测转基因抗虫玉米CM8101及其产品提供了新的参考方法。

关键词: 转基因玉米, CM8101转化体, 定性检测

Abstract:

Transgenic insect-resistant maize CM8101 is a new strain with modified Bt gene Cry1Ab?Ma syntheszied by artificial transformation. It is developed by China and has better insect resistance. At present， this strain has entered the stage of productive test， and it has important industrial application prospect in China. According to the 5′ flanking sequence information of transgenic maize CM8101， the optimal specific primer and probe combinations were designed and screened. A normal PCR assay and a real-time PCR assay for transgenic insect-resistant maize CM8101 were developed in this paper. Both methods could be used to qualitatively detect the component of transgenic insect-resistant maize CM8101 with good specificity. The results showed that the detection limit of normal PCR method was up to 0.1%， and the detection limit of real-time PCR method was up to 0.05%. Establishment of the two qualitative PCR methods provides new reference method for accurate and efficient detection of transgenic insect resistant maize CM8101 and its products in the future.

Key words: genetically modified maize, CM8101 event, qualitative detection

中图分类号:

Q785

温洪涛, 杨洋, 丁一佳, 苑冉, 张瑞英, 徐志远, 梁晋刚. 抗虫玉米CM8101定性检测方法的建立[J]. 生物技术进展, 2022, 12(2): 248-255.

Hongtao WEN, Yang YANG, Yijia DING, Ran YUAN, Ruiying ZHANG, Zhiyuan XU, Jingang LIANG. Establishment of Qualitative PCR Detection of Transgenic Insect⁃resistant Maize CM8101[J]. Current Biotechnology, 2022, 12(2): 248-255.

图/表 12

表1 引物和探针信息

Table 1 Primers and probes

引物/探针	序列(5′→3′)	引物/探针	序列(5′→3′)
CM8101⁃LB⁃F1	5′⁃AGCAAGTGTCGAGTTCAGCTCT⁃3′	CM8101⁃LB⁃R1	5′⁃AGCAATTCGGCGTTAATTCAGT⁃3′
CM8101⁃LB⁃F2	5′⁃AGCAATTAAGCAAGTGTCGAGT⁃3′	CM8101⁃LB⁃R2	5′⁃GGCGAATGCTAGAGCAATTCG⁃3′
CM8101⁃LB⁃F3	5′⁃TCAACCCATGTTAGTCTTAGCA⁃3′	CM8101⁃LB⁃R3	5′⁃CAGCCTGAATGGCGAATGCTA⁃3′
CM8101⁃LB-F4	5′⁃CGGTGCCAGAGTCAACCCAT⁃3′	CM8101⁃LB⁃R4	5′⁃CTTCCCAACAGTTGCGCAG⁃3′
CM8101⁃LB⁃F5	5′⁃TCATCCCAACATGAGCTAGTCG⁃3′	CM8101⁃LB⁃R5	5′⁃ACCCTGGCGTTACCCAACTT⁃3′
CM8101⁃LB⁃F6	5′⁃AGTCCTAAAATGTGTTCTCCCT⁃3′	CM8101⁃LB⁃qP	5′⁃FAM⁃AGCTGACCCTTCTAACACATTGCGGACGTT⁃BHQ1⁃3′

表2 引物和探针浓度组合

Table 2 Combinations of different concentrations of primer and probe

序号	终浓度/(μmol·L^-1)		序号	终浓度/(μmol·L^-1)
序号	引物	探针	序号	引物	探针
1	0.2	0.2	9	0.4	0.2
2		0.3	10		0.3
3		0.4	11		0.4
4		0.5	12		0.5
5	0.3	0.2	13	0.5	0.2
6		0.3	14		0.3
7		0.4	15		0.4
8		0.5	16		0.5

图1 转基因玉米CM8101普通PCR方法的引物组合筛选测试注：M—DL1000 marker；1—1% CM8101；2—阴性对照（受体）；3—阴性对照（其他阴性玉米）；4—空白对照。

Fig.1 Primer combination screening test of general PCR method for transgenic maize CM8101

图2 转基因玉米CM8101实时荧光PCR方法的引物组合筛选测试

Fig.2 Primer combination screening test of real?time PCR method for transgenic maize CM8101

图3 普通PCR方法反应体系和反应条件的优化

Fig.3 Optimization for reaction system and conditions of general PCR

图4 实时荧光PCR反应引物浓度优化

Fig.4 Optimization for primer concentration of real?time PCR

图5 转基因玉米CM8101普通PCR方法的特异性测试注：M—DL2000 marker；1—1% CM8101；2—阴性对照；3—空白对照；4—其他转基因玉米混合样；5—转基因水稻混合样；6—转基因大豆混合样；7—转基因棉花混合样；8—转基因油菜混合样。

Fig.5 Specificity test for general PCR of GM maize CM8101

图6 转基因玉米CM8101实时荧光PCR方法的特异性测试

Fig.6 Specificity test for real?time PCR of GM maize CM8101

图7 转基因玉米CM8101普通PCR方法的灵敏度测试注：M—DL1000 marker；1—1% CM8101；2—0.5% CM8101；3—0.1% CM8101；4—0.05% CM8101；5—0.01% CM8101；6—阴性对照；7—空白对照。

Fig.7 Sensitivity test for general PCR of GM maize CM8101

图8 转基因玉米CM8101实时荧光PCR方法的灵敏度测试

Fig.8 Sensitivity test for real?time PCR of GM maize CM8101

图9 转基因玉米CM8101普通PCR方法的检出限测试注：M—DL1000 marker；1—空白对照；2—阴性对照；3~62—0.1% CM8101。

Fig.9 Detection limit test for general PCR of GM maize CM8101

图10 转基因抗虫玉米CM8101实时荧光PCR方法的检出限测试

Fig.10 Detection limit test for real?time PCR of GM maize CM8101

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Establishment of Qualitative PCR Detection of Transgenic Insect⁃resistant Maize CM8101

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