副溶血弧菌外膜铁蛋白受体pvuA基因的原核表达及产物的诱导条件优化

doi:10.19586/j.2095-2341.2021.0152

生物技术进展 ›› 2022, Vol. 12 ›› Issue (3): 396-404.DOI: 10.19586/j.2095-2341.2021.0152

副溶血弧菌外膜铁蛋白受体pvuA基因的原核表达及产物的诱导条件优化

刘蕾¹^,²^,³(), 周欣悦¹^,²^,³, 朱桢¹^,²^,³, 曹烨¹^,²^,³, 王文彬¹^,²^,³()

^1.江苏省海洋生物产业技术协同创新中心，江苏连云港 222005
^2.江苏省海洋生物资源与环境重点实验室，江苏连云港 222005
^3.江苏海洋大学食品科学与工程学院，江苏连云港 222005

收稿日期:2021-09-13 接受日期:2021-10-28 出版日期:2022-05-25 发布日期:2022-05-26
通讯作者: 王文彬
作者简介:刘蕾E-mail:1796591801@qq.com；

Prokaryotic Expression of Outer Membrane Ferritin Receptor pvuA Gene of Vibrio parahaemolyticus and Optimization of Induction Conditions for Product

Lei LIU¹^,²^,³(), Xinyue ZHOU¹^,²^,³, Zhen ZHU¹^,²^,³, Ye CAO¹^,²^,³, Wenbin WANG¹^,²^,³()

^1.Jiangsu Marine Biological Industry Technology Collaborative Innovation Center，Jiangsu Lianyungang 222005，China
^2.Jiangsu Key Laboratory of Marine Bioresources and Environment，Jiangsu Lianyungang 222005，China
^3.School of Food Science and Engineering，Jiangsu Ocean University，Jiangsu Lianyungang 222005，China

Received:2021-09-13 Accepted:2021-10-28 Online:2022-05-25 Published:2022-05-26
Contact: Wenbin WANG

摘要/Abstract

摘要：

为构建弧菌铁蛋白受体pvuA重组质粒，提高其在大肠杆菌BL21中的表达产量，优化表达条件，并为其免疫原性研究奠定基础，从副溶血弧菌基因组DNA扩增了弧菌铁蛋白受体pvuA基因，构建了重组质粒pET-28a(+)-ferric vibrioferrin receptor，转入大肠杆菌BL21并经异丙基硫代半乳糖苷（isopropyl β-D-thiogalactoside，IPTG）诱导表达蛋白。在单因素试验的基础上，以菌体初始浓度、诱导时间、诱导温度、诱导剂浓度为自变量，菌体蛋白浓度为响应值，根据响应面法的Box-Benhnken中心设计原理，研究自变量及其交互作用对弧菌铁蛋白产量的影响，利用Design-Expert和响应面分析相结合的方法对诱导条件进行优化。IPTG诱导获得的重组蛋白以包涵体的形式存在，优化后最终确定重组弧菌铁蛋白受体pvuA最佳表达条件为菌体初始浓度OD₆₀₀=0.6，诱导时间10 h，诱导温度37 ℃，IPTG浓度为1.0 mmol·L^-1，此时包涵体沉淀中蛋白含量最高，为11.00 mg·mL^-1。构建了弧菌铁蛋白受体pvuA的大肠杆菌重组表达质粒，通过优化表达条件提高了纯化蛋白产率，为研究弧菌铁蛋白受体蛋白的多克隆抗体的制备和应用奠定了基础。

关键词: 副溶血性弧菌, 外膜蛋白, 响应面法, 条件优化

Abstract:

To obtain the recombinant plasmid of ferric vibrioferrin receptor pvuA and improve the expression yield of pvuA in Escherichia coli BL21， optimize the expression conditions， and lay a foundation for its immunogenicity study， the ferric vibrioferrin receptor gene pvuA was amplified from the genomic DNA of Vibrio parahaemolyticus. The recombinant plasmid pET-28a （+） - ferriferrin receptor was constructed， transformed into E. coli BL21， and induced by isopropyl β-D-thiogalactoside （IPTG）. Based on the single factor experiment， the effects of independent variables and their interaction on the production yield of ferric vibrioferrin receptor were studied by response surface methodology. The independent variables were initial cell concentration， induction time and induction temperature， inducer concentration， and the response value was the yield of bacterial protein. The induction conditions were optimized by the combination of Design Expert and response surface analysis. The ferric vibrioferrin receptor was expressed as inclusion bodies. The optimal expressioninitial cell concentration was OD₆₀₀=0.6， temperature was 37 ℃， induction time was 10 h， IPTG concentration was 1.0 mmol·L^-1. At this time， the protein content of inclusion bodies precipitation was the highest （11.00 mg·mL^-1）. The E. coli recombinant plasmid of ferric vibrioferrin receptor pvuA was constructed， the yield of purified protein was improved by optimizing the expression conditions， which laid a foundation for the preparation and application of polyclonal antibody against Vibrio spp..

Key words: Vibrio parahaemolyticus, outer membrane protein, response surface methodology, condition optimization

中图分类号:

S942.5

刘蕾, 周欣悦, 朱桢, 曹烨, 王文彬. 副溶血弧菌外膜铁蛋白受体pvuA基因的原核表达及产物的诱导条件优化[J]. 生物技术进展, 2022, 12(3): 396-404.

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图/表 12

表1 RSA设计中定量因子的水平及编码

Table 1 Levels and code of RSA test factors

编码	因素	水平
A	初始浓度OD₆₀₀	0.4	0.6	0.8
B	诱导时间/h	8	10	12
C	诱导温度/℃	16	37	42
D	诱导剂浓度/(mmol·L^-1)	0.5	0.8	1.0

图1 弧菌铁蛋白受体pvuA基因PCR产物注：M—DNA分子标准量; 1—弧菌铁蛋白受体。

Fig. 1 PCR product of ferricvibrioferrin receptor pvuA gene

图2 弧菌铁蛋白受体重组质粒PCR验证注：M—DNA分子量标准; 1—副溶血性弧菌基因组DNA； 2~7—依次为抗性平板上的单菌落1、2、3、4、5、6。

Fig. 2 PCR verification of ferric vibrioferrin receptor recombinant plasmid

图3 重组蛋白诱导表达注：M—蛋白分子标准量; 1~2—pET28a 诱导上清、诱导沉淀; 3~4—弧菌铁蛋白受体诱导上清、诱导沉淀。

Fig. 3 Expression induction of recombinant protein

图4 IPTG浓度优化注：M—蛋白分子标准量; 1, 3, 5, 7—0.2, 0.5, 0.8, 1.0 mmol·L-1 诱导上清; 2, 4, 6, 8—0.2, 0.5, 0.8, 1.0 mmol·L-1 诱导沉淀。

Fig. 4 Optimization of IPTG concentration

图5 起始菌液浓度优化注：M—蛋白分子标准量; 1—OD600=0.4时诱导上清; 2—OD600=0.4时诱导沉淀; 3—OD600=0.6时诱导上清; 4—OD600=0.6时诱导沉淀; 5—OD600=0.8时诱导上清; 6—OD600=0.8时诱导沉淀。

Fig. 5 Optimization of the initial bacterial concentration

图6 诱导温度优化注：M—蛋白分子标准量; 1~2—16 ℃诱导上清、诱导沉淀; 3~4—28 ℃诱导上清、诱导沉淀; 5~6—37 ℃诱导上清、诱导沉淀; 7~8—42 ℃诱导上清、诱导沉淀。

Fig. 6 Optimization of induction temperature

图7 诱导时间优化注：M—蛋白分子标准量; 1~2—8 h 诱导上清、诱导沉淀; 3~4—10 h 诱导上清、诱导沉淀; 5~6—12 h诱导上清、诱导沉淀; 7~8—14 h 诱导上清、诱导沉淀。

Fig. 7 Optimization of induction time

表2 试验设计与结果

Table 2 Experimental design and results

试验编号	A:初始浓度OD₆₀₀	B:诱导时间/h	C:诱导温度/℃	D:诱导剂浓度/（mmol·L^-1）	蛋白浓度/(mg·mL^-1)
1	0.4	8	37	0.8	5.66
2	0.6	8	37	1.0	7.98
3	0.8	10	37	0.5	6.89
4	0.6	10	16	0.5	6.02
5	0.6	12	37	1.0	8.92
6	0.6	8	42	0.8	7.33
7	0.6	10	37	0.8	8.61
8	0.6	12	42	0.8	8.27
9	0.8	10	42	0.8	6.44
10	0.6	10	37	1.0	10.58
11	0.6	10	37	1.0	10.58
12	0.4	10	37	0.5	5.27
13	0.6	10	42	0.5	6.74
14	0.8	10	37	1.0	8.91
15	0.4	10	42	0.8	6.04
16	0.6	10	37	0.8	8.98
17	0.8	8	37	0.8	7.08
18	0.6	8	37	0.5	6.12
19	0.6	10	42	1.0	7.24
20	0.8	10	16	0.8	6.28
21	0.6	10	37	1.0	10.58
22	0.6	12	16	0.8	7.07
23	0.8	12	37	0.8	7.32
24	0.4	10	37	1.0	5.54
25	0.6	10	16	1.0	6.89
26	0.6	12	37	0.5	7.84
27	0.4	10	16	0.8	5.33
28	0.4	12	37	0.8	5.88
29	0.6	8	16	0.8	6.54

表3 回归方程各方差分析

Table 3 Analysis of variance of regression equation

来源	平方和	自由度	平方和	F值	P值
模型	57.97	14	4.14	6.27	0.000 7
A	3.74	1	3.74	5.6	0.032 1
B	0.81	1	0.81	1.23	0.286 5
C	1.11	1	1.11	1.69	0.215 0
D	5.32	1	5.32	8.06	0.013 1
AB	0.000 1	1	0.000 1	0.000 1	0.990 4
AC	0.063	1	0.063	0.095	0.762 1
AD	0.47	1	0.47	0.71	0.415 1
BC	0.026	1	0.026	0.040	0.845 2
BD	0.063	1	0.063	0.095	0.762 5
CD	0.080	1	0.080	0.12	0.732 4
A²	22.02	1	22.02	33.36	<0.000 1
B²	3.82	1	3.82	5.79	0.030 5
C²	8.85	1	8.85	13.42	0.002 6
D²	1.40	1	1.40	2.12	0.167 1
残差	9.24	14	0.66
失拟项	9.17	11	0.83	36.55	0.106 5
纯误差	0.068	3	0.023
总离差	67.21	28

图8 菌体初始浓度与诱导温度、诱导剂浓度、诱导时间对菌体蛋白产量影响的响应面与等高线图

Fig. 8 Response surface and contour map of the effects of initial cell concentration with induction temperature, inducer concentration and induction time on the production of bacterial protein

图9 重组蛋白纯化注：M—蛋白分子标准量; 1—重组蛋白。

Fig. 9 The recombinant protein purification

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