慢病毒载体p24蛋白含量的ELISA检测方法的建立与应用

doi:10.19586/j.2095-2341.2022.0172

生物技术进展 ›› 2023, Vol. 13 ›› Issue (3): 457-464.DOI: 10.19586/j.2095-2341.2022.0172

慢病毒载体p24蛋白含量的ELISA检测方法的建立与应用

刘超(), 张玉柯(), 刘华()

星汉德（上海）生物医药有限公司，上海 200120

收稿日期:2022-10-26 接受日期:2022-11-14 出版日期:2023-05-25 发布日期:2023-06-12
通讯作者: 刘华
作者简介:刘超与张玉柯为本文共同第一作者。刘超 E-mail: 81364895@qq.com
张玉柯 E-mail: zhangyuke529@126.com

Establishment and Application of ELISA Assay for Detection of p24 Protein Content of Lentivirus Vector

Chao LIU(), Yuke ZHANG(), Hua LIU()

SCG（Shanghai） Cell Therapy Co. Ltd. ，Shanghai 200120，China

Received:2022-10-26 Accepted:2022-11-14 Online:2023-05-25 Published:2023-06-12
Contact: Hua LIU

摘要/Abstract

摘要：

测定慢病毒载体p24蛋白含量的商业化试剂盒存在成本高、检测线性范围窄和货源可控性差等不足，为解决上述问题，采用由一对鼠抗p24蛋白的单克隆抗体作为捕获抗体与检测抗体，其中检测抗体进行生物素偶联来建立p24蛋白定量的双抗体夹心ELISA检测方法。通过方阵滴定法确定双抗夹心ELISA实验中的包被抗体与检测抗体的最佳工作浓度。对该方法进行了标准曲线线性范围、定量下限、准确度、精密度、特异性等的考察。取本公司自主研发生产的6个批次的慢病毒载体样品进行p24蛋白定量检测和放置稳定性来考察方法的适用性。实验结果显示，双抗夹心ELISA方法中包被抗体和生物素标记检测抗体的最优工作浓度分别为0.8 μg·mL^-1和0.005 μg·mL^-1，方法在1.25~80.00 ng·mL^-1浓度区间有最佳线性，相关系数r²>0.95。批内和批间检测高、中、低质控品的回收率在80%~120%之间，变异系数均小于10.0%，定量检测下限为1.25 ng·mL^-1。同一种慢病毒载体6批次的p24蛋白含量检测结果均在30%偏差范围内，4批次样本放置8 h的稳定性检测结果偏差均在10%范围内。对双抗体夹心ELISA法进行了优化开发和全面验证，旨在提升慢病毒载体p24蛋白含量的定量检测水平，以及为慢病毒载体工艺开发、质量控制和批次之间质量的一致性研究提供重要的数据支撑和理论依据。

关键词: 慢病毒载体, ELISA, p24蛋白

Abstract:

In order to solve the problems of high cost， narrow detection linear range and poor source controllability of commercial kits for determining the content of p24 protein in lentivirus vector， a pair of mouse monoclonal antibodies against p24 protein were used as capture antibodies and detection antibodies， and the detection antibodies were coupled with biotin to establish a double antibody sandwich ELISA method for quantitative detection of p24 protein. The best working concentration of coated antibody and detection antibody in double antibody sandwich ELISA were determined by square matrix titration. The linearity range， lower limit of quantification， accuracy， precision and specificity of the standard curve were investigated. Six batches of lentivirus vector samples produced by our company were used to detect p24 content and sample stability were investigated for method fitness. The experimental results showed that the optimal working concentrations of coated antibody and biotin labeled antibody in double antibody sandwich ELISA were 0.8 μg·mL^-1 and 0.005 μg·mL^-1， the method had the best linearity in the concentration range of 1.25~80.00 ng·mL^-1， and the correlation coefficient r²>0.95. The recovery of intra and inter assay for high， medium and low quality control sample were 80%~120%， the coefficient of variation was less than 10.0%， and the lower limit of quantitative detection was 1.25 ng·mL^-1. The detection results of p24 protein content of 6 batches of the same lentivirus vector were within 30% deviation， and the detection results of storage stability of 4 batches of samples within 8 hours were within 10% deviation. The double antibody sandwich ELISA method has been optimized， developed and fully validated， which could be used for quantitative detection of lentivirus vector p24 protein content， and provide important data support and theoretical basis for lentivirus vector process development， quality control and quality consistency between batches.

Key words: lentivirus vector, ELISA, p24 protein

中图分类号:

Q939.47

刘超, 张玉柯, 刘华. 慢病毒载体p24蛋白含量的ELISA检测方法的建立与应用[J]. 生物技术进展, 2023, 13(3): 457-464.

Chao LIU, Yuke ZHANG, Hua LIU. Establishment and Application of ELISA Assay for Detection of p24 Protein Content of Lentivirus Vector[J]. Current Biotechnology, 2023, 13(3): 457-464.

图/表 14

参考文献 12

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包被抗体浓度	检测抗体1浓度	H样本(80.000 ng·mL^-1)OD值	L样本 (0.625 ng·mL^-1)OD值	BLK OD值	H样本(80.000 ng·mL^-1)P/N值	L样本(0.625 ng·mL^-1)P/N值
0.8 μg·mL^-1	0.010 μg·mL^-1	2.154	0.173	0.103	20.9	1.7
0.8 μg·mL^-1	0.005 μg·mL^-1	1.617	0.149	0.082	19.7	1.8
0.5 μg·mL^-1	0.010 μg·mL^-1	1.593	0.077	0.038	41.9	2.0
0.5 μg·mL^-1	0.005 μg·mL^-1	1.380	0.139	0.096	14.4	1.4

包被抗体浓度	检测抗体1浓度	H样本(80.000 ng·mL^-1)OD值	L样本 (0.625 ng·mL^-1)OD值	BLK OD值	H样本(80.000 ng·mL^-1)P/N值	L样本(0.625 ng·mL^-1)P/N值
0.8 μg·mL^-1	0.010 μg·mL^-1	2.154	0.173	0.103	20.9	1.7
0.8 μg·mL^-1	0.005 μg·mL^-1	1.617	0.149	0.082	19.7	1.8
0.5 μg·mL^-1	0.010 μg·mL^-1	1.593	0.077	0.038	41.9	2.0
0.5 μg·mL^-1	0.005 μg·mL^-1	1.380	0.139	0.096	14.4	1.4

工作标准品编号理论浓度/(ng·mL^-1)	次数	STD01	STD02	STD03	STD04	STD05	STD06	STD07	STD08	STD09
工作标准品编号理论浓度/(ng·mL^-1)	次数	1.25	2.00	4.00	8.00	15.00	30.00	40.00	60.00	80.00
实测值/(ng·mL^-1)	第1次	1.241	2.012	4.048	7.936	14.690	30.581	40.508	60.945	77.017
	第2次	1.236	2.035	4.003	7.980	14.644	30.594	42.055	56.683	80.904
	第3次	1.240	2.016	4.046	7.947	14.639	30.669	40.442	61.310	76.746
平均值/(ng·mL^-1)		1.240	2.020	4.030	7.950	14.660	30.610	41.000	59.650	78.220
变异系数（%）		0.2	0.6	0.6	0.3	0.2	0.2	2.2	4.3	3.0
回收率（%）		99.1	101.1	100.8	99.4	97.7	102.0	102.5	99.4	97.8

工作标准品编号理论浓度/(ng·mL^-1)	次数	STD01	STD02	STD03	STD04	STD05	STD06	STD07	STD08	STD09
工作标准品编号理论浓度/(ng·mL^-1)	次数	1.25	2.00	4.00	8.00	15.00	30.00	40.00	60.00	80.00
实测值/(ng·mL^-1)	第1次	1.241	2.012	4.048	7.936	14.690	30.581	40.508	60.945	77.017
	第2次	1.236	2.035	4.003	7.980	14.644	30.594	42.055	56.683	80.904
	第3次	1.240	2.016	4.046	7.947	14.639	30.669	40.442	61.310	76.746
平均值/(ng·mL^-1)		1.240	2.020	4.030	7.950	14.660	30.610	41.000	59.650	78.220
变异系数（%）		0.2	0.6	0.6	0.3	0.2	0.2	2.2	4.3	3.0
回收率（%）		99.1	101.1	100.8	99.4	97.7	102.0	102.5	99.4	97.8

实验次数	测定值/(ng·mL^-1)	回收率/%	变异系数/%
第1次	1.250	100.0	3.2
第2次	1.254	100.3	3.2
第3次	1.240	99.2	0.3
第4次	1.270	101.6	1.2
第5次	1.240	99.2	0.3
第6次	1.240	99.2	2.7
第7次	1.220	97.6	0.5
第8次	1.250	100.0	3.1
第9次	1.240	99.2	0.2
第10次	1.250	100.0	0.6
第11次	1.260	100.8	4.8
第12次	1.210	96.8	3.5

慢病毒载体p24蛋白含量的ELISA检测方法的建立与应用

Establishment and Application of ELISA Assay for Detection of p24 Protein Content of Lentivirus Vector

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分析人员	试验次数	质控品浓度/(ng·mL^-1)
分析人员	试验次数	高	中	低
1	1	47.65	24.94	5.97
	2	47.74	24.43	6.20
	3	49.37	23.78	5.82
实测平均值		48.25	24.39	6.00
平均回收率/%		101	102	100
变异系数/%		2.0	2.0	3.0

质控品名称	质控品浓度/(ng·mL^-1)	平均实测浓度/(ng·mL^-1)	变异系数/%	回收率/%
高¹	48	34.0	0.8	70.8
中¹	24	15.9	2.0	66.3
低¹	6	3.9	1.4	65.0
高²	48	50.0	0.3	104.1
中²	24	24.5	0.3	102.1
低²	6	6.08	0.4	101.3

稀释线性样品	理论浓度/(ng·mL^-1)	试验1	试验2	试验3	平均实测浓度/(ng·mL^-1)	变异系数/%	回收率/%
L-1	100	102.99	80.76	93.70	92.48	12.1	92.5
L-2	80	71.98	68.46	76.80	72.41	5.8	90.5
L-3	60	60.78	54.40	59.90	58.36	5.9	97.3
L-4	48	49.34	43.85	48.90	47.36	6.4	98.7
L-5	24	23.27	22.82	23.70	23.26	1.9	96.9
L-6	2	1.95	1.91	2.00	1.95	2.2	97.7
L-7	1	1.02	0.94	1.00	0.99	4.6	98.6

检测样品名称	试验次数	OD值	检测浓度/(ng·mL^-1)
制剂缓冲液	第1次	0.053 2	<LOQ
制剂缓冲液	第2次	0.085 0	<LOQ
Blank	第1次	0.055 2	<LOQ
Blank	第2次	0.046 0	<LOQ
HEK293 HCP	第1次	0.053 0	<LOQ
HEK293 HCP	第2次	0.085 0	<LOQ

慢病毒载体样品	p24蛋白含量/(ng·mL^-1)	平均值/(ng·mL^-1)	偏差/%
样品批次1	20 850	21 829	-4.5
样品批次2	19 500		-10.7
样品批次3	17 500		-19.8
样品批次4	28 000		28.3
样品批次5	23 250		6.5
样品批次6	21 875		0.2

样品放置稳定性时间窗	批次1/(ng·mL^-1)	偏差/%	批次2/(ng·mL^-1)	偏差/%	批次3/(ng·mL^-1)	偏差/%	批次4/(ng·mL^-1)	偏差/%
0 h	39 080.0	NA	23 457.5	NA	18 618.8	NA	20 850.0	NA
2 h	39 586.3	1.3	23 511.3	0.2	17 577.5	-5.6	20 490.0	-1.7
4 h	40 292.5	3.1	21 348.8	-9.0	18 052.5	-3.0	19 238.8	-7.7
8 h	38 458.8	-1.6	21 607.5	-7.9	17 963.8	-3.5	18 850.0	-9.6

慢病毒载体	p24蛋白含量/(ng·mL^-1)	病毒颗粒数/（×10¹¹ LP）	感染滴度/（×10⁷TU·mL^-1）	比活性(TU/LP)
批次1	43 662.5	5.46	8.06	1/6 756
批次2	20 850	2.61	5.88	1/4 424
批次3	19 500	2.44	6.07	1/4 016
批次4	17 500	2.19	11.1	1/1 972

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